آرتمیا، میکرولیتر، بافر، ، پروتئین

دانلود پایان نامه
وزن مرطوب100 آرتمیا=TW
3-8-4- وزن خشک انفرادی آرتمیا
نمونه مرطوب پس از توزین، به مدت 24 ساعت به یک آون با دمای 60 درجه منتقل شده سپس مجددا توزین شده و وزن خشک انفرادی از رابطه زیر محاسبه گردید:
رابطه3-5- فرمول تعیین وزن خشک انفرادی آرتمیا: DW= TW/100
وزن خشک انفرادی =DW
وزن خشک100 آرتمیا =TW
3-8-5- درصد خاکستر لاشه
نمونه ها پس از تعیین وزن خشک به درون بوته های چینی کوچک منتقل شده و به مدت4 ساعت درون کوره الکتریکی (مدل Muffle Furnance ساخت شرکت ایران خودساز) تحت دمای500 درجه سانتیگراد قرارد داده شدند. پس از سرد شدن بوته های چینی نمونه ها در یک ترازوی دیجیتال با دقت 00001/0 گرم وزن شدند (برای هر تیمار غذایی سه نمونه تهیه شد).
رابطه 3-6- فرمول درصد خاکستر لاشه: =(E-B) / (D-B)× 100درصد خاکستر نمونه
وزن بوته خالی =B
وزن ظرف با نمونه خشک =D
وزن ظرف با خاکستر=E
3-8-6- ضریب تبدیل غذایی (FCR)
ضریب تبدیل غذایی در این سیستم برای غذاهای غیرزنده سبوس گندم و سویا و براساس وزن خشک این منابع غذایی (بدون احتساب سهم اندک جلبک سبز مصرف شده در کنار این غذاها) در پایان روز 17 با استفاده از رابطه زیر محاسبه شد:
رابطۀ 3-7- محاسبه میزان ضریب تبدیل غذایی:
بیوماس تولید شده (mg)/ غذای مصرفی بر حسب وزن خشک (mg)= ضریب تبدیل غذایی (FCR)
3-8-7- نرخ رشد ویژه(SGR)
نرخ رشد ویژه یا درصد افزایش روزانه در وزن آرتمیا نیز در پایان روز 17 بر حسب وزن مرطوب طبق رابطه زیر محاسبه گردید :(DeSilva & Anderson, 1995)
رابطه 3-8- نحوه محاسبه نرخ رشد ویژه: SGR %= (Ln(W2)-Ln(W1))/15×100
که در این رابطه:
وزن انفرادی نهایی مرطوب آرتمیا در پایان روز 17 ام =W1
وزن اولیه مرطوب یک ناپلیوس تازه تفریخ شده =W2
3-8-8- چربی کل
برای این منظور از روش استخراج به کمک حلال دی اتیل اتر استفاده شد.
3-8-9- پروفایل اسیدهای چرب
برای این منظور در این مطالعه از پروتکل استخراج مستقیم متیل استر به روش استاندارد استفاده گردید(AOAC, 1990):
در نهایت درصد هر اسید چرب به کل اسیدهای چرب هر نمونه با مقایسه طول منحنی های هر اسید چرب با طول منحنی استاندارد داخلی محاسبه شدند .(Lepage & Roy, 1984)

3-9- روش تهیه و کشت باکتری لاکتوباسیلوس رامنوسوس
این باکتری ها به صورت لیوفیلیزه بوده و در ابتدا در شرایط استریل و در زیر هود لامینار فلو محتویات ویال در 10 میلی لیتر از محیط کشت MRS براث و به مدت 24 ساعت در شرایط هوازی و در دمای 30 درجه سانتی گراد کشت داده شد. پس از کشت، ساب کالچرهایی از آن آنها تهیه و تا زمان استفاده در دمای 80- درجه سانتی گراد و در حضور 40% گلیسیرین نگهداری شد. همچنین نمونه هایی از باکتریهای کشت شده برای تشخیص جنس و گونه آن با تستهای بیوشیمیایی مورد بررسی گرفت. برای تغذیه آرتمیا، این باکتریها به صورت روزانه در محیط کشت MRS براث کشت داده شد. پس از رشد (ایجاد کدورت) محیط ها به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد و rpm2500 سانتریفیوژ شد. پس از این مرحله، محلول رویی دور ریخته شد و رسوب حاصل 2 مرتبه با سرم فیزیولوژی استریل شستشو شد. رسوب حاصل در سرم فیزیولوژی استریل سوسپانسیون شده و براساس جدول غذادهی استاندارد و درصد شراکت آن در تغذیه آرتمیا، به به محیط اضافه شد.
3-10- آزمایشات مربوط به آنزیم
3-10-1- تهیه عصاره آنزیمی
برای تعیین مقدار و میزان فعالیت آنزیمهای گوارشی آرتمیا از روش استاندارد استفاده گردید و سوبستراهای مورد استفاده در این آزمایش به ترتیب برای آلکالین پروتئاز، لیپاز و آمیلاز شامل آزوکازئین ، پارانیتروفنیل مریستات و نشاسته بود (Bernfeld, 1951; Worthington, 1991).

شکل3-5- استخراج آنزیمی
3-10-2- سنجش غلظت پروتئین محلول
پروتئین محلول نمونه های هموژن شدۀ آرتمیا فرانسیسکانا در تیمارهای غذایی، به روش Bradford (1976) سنجیده شد. جهت انجام این کار از آلبومین سرم گاوی (BAS)به عنوان استاندارد استفاده گردید.
3-10-3- سنجش میزان فعالیت آنزیم آلفا- آمیلاز
فعالیت آنزیم آمیلاز براساس روش Bernfeld(1955) و با استفاده از سوبسترای نشاسته سنجش گردید. برای این منظور ابتدا معرف رنگی دی نیترو سالسیلیک اسید (DNS) از طریق حل نمودن 5/0 گرم پودر 2 و 5 و 3 هیدروکسی دی نیترو بنزوئیک اسید در 25 میلی لیتر آب مقطر و اضافه نمودن 15 گرم سدیم پتاسیم تارتارات و 10 میلی لیتر سود(NaOH) 2 نرمال و رساندن حجم محلول به 50 میلی لیتر تهیه گردید. برای تهیۀ نشاسته 1 درصد، 1 گرم نشاسته بافر فسفات سدیم 02/0 مولار حاوی کلرید سدیم 006/0 مولار، 9/6pH= حل گردید و سپس به آرامی حجم آن تا 100 میلیلیتر رسانده می شود. محلول ذخیرۀ مالتوزmole ml-1 5 بود.
برای سنجش فعالیت آنزیم،50 میکرولیتر از عصاره تهیه شده از تیمار های مختلف آرتمیا.(عصاره آنزیمی) به لوله ای شیشه ای حاوی 100 میکرولیتر بافر استات 05/0 مولار و 50 میکرو لیتر محلول نشاسته 2% (w/v) (محلول نشاسته، Merck) در بافر استات افزوده شد. لوله شیشه ای در حمام آب 40 درجه سانتی گراد قرار داده شد تا واکنش به مدت 5 دقیقه ادامه یابد سپس 1 میلی لیتر از مخلوط به لوله شیشه ای دیگر حاوی 1 میلی لیتر معرف DNS اضافه گردید و به مدت 10 دقیقه جوشانده شد.
برای تهیه نمونه Blank نیز همه مراحل بالا انجام گرفت و فقط به جای عصاره هموژن آرتمیا از 50 میکرولیترآب استفاده کرده ایم. سپس جذب نمونه ها به وسیله دستگاه اسپکتروفتومتر (Shimatzu 160-UV) در طول موج 520 نانومتر به عنوان فعالیت آمیلاز قرائت گردید. بدین ترتیب فعالیت ویژه آمیلاز با تقسیم نمودن فعالیت آمیلاز در نمونه ها برای میزان پروتئین محلول بدست آمده در هر نمونه برحسب IU/mg protein بدست آمد.
واحد فعالیت آلفا- آمیلاز، بر حسب میکرو مول مالتوز آزاد شده تحت اثر آنزیم در دقیقه به ازای میلی گرم پروتئین محاسبه شد (Worthington, 1991).
3-10-4- سنجش میزان فعالیت آنزیم لیپاز
فعالیت لیپازی با استفاده از هیدرولیز P-nitrophenylemyristateو به طریق اسپکتروفتومتری تعیین گردید.
برای هر سنجش لیپازی 6 میکرولیتر از عصاره¬ی آنزیمی آرتمیا به 86 میکرولیتر محلول بافر Sodium cholate و 5/2 میکرولیتر محلول متوکسی اتانول اضافه گردید. سپس 5/5 میکرولیتر سوبسترای پارا نیتروفنول مریستات به محلول فوق اضافه گردید و میزان جذب بادستگاه اسپکتوفتومتری در دمای 30 درجه سانتی¬گراد به مدت 15 دقیقه و در طول موج 405 نانومتر قرائت گردید (Iijima, 1998). برای تهیه نمونه های بلانک میزان 5/5 میکرولیتر از سوبسترا، 5/2 میکرولیتر از 2- متوکسی اتانل و 92 میکرولیتر سدیم کلات مخلوط کرده و همراه با نمونه های دیگر برای سنجش غلظت از دستگاه اسپکتروفتومتر استفاده شد.
3-10-5- سنجش میزان فعالیت آنزیم آلکالین پروتئاز
سنجش فعالیت آنزیم پروتئاز با استفاده از محلول سوبسترا آزوکازئین 2 درصد در 50 میلی مولار بافر Tris-Hcl در 5/7 pH= صورت پذیرفت.
برای اینکار ابتدا 20 میکرولیتر از نمونۀ عصارۀ آنزیمی با 5/0 میلی لیتر Azocasein 2 در صد در بافر Tris/Hclدر دمای 25 درجۀ سانتی گراد به مدت 10 دقیقه تحت انکوباسیون قرار گرفت. پس از انکوباسیون 5/0 میلی لیتر از محلول TCA (Trichloroaceticacid) جهت توقف واکنش به محلول فوق اضافه گردید. سپس میکروتیوب ها به مدت 5 دقیقه با سرعت g×6500 سانتریفوژ شدند. سرانجام محلول رویی هر میکرو تیوپ را داخل میکروپلت ته صاف ریخته و میزان جذب آنها بادستگاه اسپکتوفتومتری (Bioteksynergy HT) ساخت کشور آمریکا با طول موج 440 نانومتر قرائت شدند. فعالیت ویژه آلکالین پروتئاز به ازای مدت انکوباسیون (10دقیقه) و میزان پروتئین عصارۀ آنزیمی (میلی گرم) محاسبه شد (Garcia-carreno et al., 1993).
3-11- تجزیه و تحلیل آماری داده ها
این تحقیق در قالب یک طرح آماری کاملا تصادفی انجام شد. داده ها به صورت میانگین ± انحراف از معیار میانگین ها (Mean±SE) گزارش شدند. با استفاده از معادله توزیع نرمال و رسم منحنی مربوطه، همه داده ها نرمال تشخیص داده شدند. تمام داده ها با استفاده از روش آنالیز واریانس دو طرفه (two-way ANOVA) مورد ارزیابی قرار گرفتند. زمانی که اختلاف ها معنی دار بود (P<0.05)، از آزمون مقایسه میانگین توکی برای جداسازی تیمارها استفاده شد. تمام آنالیزهای آماری توسط نرم افزار آماری SPSS 19 Inc., Chicago, IL, USAانجام گرفت.
فصل چهارم: نتایج
* در تمامی جداول تیمار 1 (DS)، تیمار 2 (WB+DS)، تیمار 3 (RB+DS)، تیمار 4 (WB+RB+DS)، تیمار 5 (DS+P)، تیمار 6 (WB+DS+P)، تیمار 7 (RB+DS+P) و تیمار 8 (WB+RB+DS+P) معرفی می گردد که در این تیمارها DS ( جلبک دونالیلا سالینا)، WB (سبوس گندم)، RB ( سبوس برنج) و P (پروبیوتیک لاکتوباسیلوس رامنوسوس) می باشد.

نتایج رشد و بازماندگی در 8 تیمار با جیره های غذایی جلبک دونالیلا سالینا، سبوس گندم، سبوس برنج و مخلوط سبوس گندم/سبوس برنج بدون پروبیوتیک لاکتوباسیلوس رامنوسوس و همراه با این پروبیوتیک که در این تحقیق بر روی آرتمیا فرانسیسکانا انجام شد بصورت زیر می باشد:
4-1- طول (رشد)
نتایج مربوط به شاخص افزایش طول آرتمیا در جیره های غذایی مختلف در شکل 4-1 آورده شده است. بر این اساس بیشترین میزان رشد در پایان روز هفدهم (05/0±21/8 میلی متر) مربوط به تیمار6 (سبوس گندم و جلبک دونالیلا سالینا و پروبیوتیک لاکتوباسیلوس رامنوسوس) می باشد که با تیمارهای دیگر (به غیر از تیمارهای 3و 5) در این مطالعه بطور معنی داری از نظر آماری اختلاف داشتند (05/0>p) (نمودار4-1).
جدول4-1- آنالیز واریانس طول کل آرتمیا فرانسیسکانا
در گروه های مختلف در پایان دوره پرورش
منبع درجه آزادی Pvalue
پروبیوتیک 1 037/0
نوع غذا 3 000/0
پروبیوتیک* نوع غذا 3 000/0*
خطا 16
کل 23

کمترین طول آرتمیا (03/0±76/6) مربوط به تیمار4 (جیره ترکیبی سبوس برنج و سبوس گندم و جلبک دونالیلا سالینا) بود که با تمام تیمارها به غیر از تیمار 8 (جیره ترکیبی سبوس برنج و سبوس گندم و جلبک دونالیلا سالینا همراه با پروبیوتیک) از نظر آماری اختلاف معنی داری داشتند (05/0p). این نتایج مشخص می کند که تیمارهای 8 (03/0±9/6 میلی متر) و 4 (03/0±76/6 میلی متر) در مقایسه با تیمارهای دیگر کمترین میزان طول را داشتند.

شکل4-1- اثر متقابل پروبیوتیک- نوع غذا در طول کل آرتمیا فرانسیسکانا در دوره 17 روز پرورش