1-11-1-ادهزین¬ها و پروتئین¬های غشا خارجی
فاکتورهای باکتریال به واسطه ادهزین در هلیکوباکتر پیلوری متصل به اپیتلیوم معده هستند. شمار این ادهزین ها نشان دهنده اهمیت آنها برای باکتری است اما آزمایش جداگانه هر کدام از ادهزین¬ها بسیار مشکل است. در اینجا درباره سه Hop پروتئین مهم که اطلاعات کافی از آن¬ها در دست است بحث می¬شود تا نقش آن¬ها در پاتوژنز عفونت با هلیکوباکتر پیلوری را مشخص کنیم [83].
-( BabA(Hop s
پروتئین 78 کیلو دالتونی BabA در گونه¬های هلیکوباکتر پیلوری مولد ادهزین¬های قوی وجود دارد وتوسط ژن BabA کد می¬شود. برای ژن BabA دو آلل BabA1 و BabA2 وجود دارد، اما به دلیل وارد شدن یک سکانس 10 جفت بازی به انتهای΄ 3 ژن، فقط آلل BabA2 قادر به کد کردن یک پروتئین ادهزین فعال باکتریایی است. مطالعات انجام شده بر روی حیوانات نشان داده که ادهزین میانجی BabA برای کلونیزه شدن و بیماری زایی هلیکوباکتر پیلوری لازم است[84]. ویژگی های اتصالی BabA تطبیق هلیکوباکتر پیلوری با الگوهای متفاوت گلیکوزیلاسیون را منعکس می کند. این الگوها در جمعیتی از میزبانان اختصاصی غالب است و اتصال به Lewis b به واسطه BabA می تواند بوسیله هم تغییر فاز در هلیکوباکتر پیلوری و هم اصلاح ژنتیکی باشد. حضور BabA2 همراه با CagA و آلل هایVacA s1 است و سویه هایی که این 3 ژن را دارند، ریسک بالایی را برای سرطان معده همراه خود دارا هستند[85].
(HOP H) opiA :
پروتئین 34 کیلو دالتونی opiA یکی از اعضای خانواده Hop protein است که اکنون به عنوان ادهزین شناخته می¬شود. در ابتدا این پروتئین به عنوان یک القا کننده پاسخ پیش التهابی شناخته می¬شد . ژن کد کننده آن در همه سویه¬های هلیکوباکتر پیلوری وجود دارد اما بیان آن از طریق تغییر فاز تنظیم می¬شود. این تغییر فاز در اثر تعداد متنوع تکرارهای دی نوکلوئید در انتهای΄ 5 پروتئین opiA به وجود می¬آید. بیان پروتئین opiA به شدت با بیان IL-8 هم در in vivo و هم در in vitro مرتبط است. از آنجایی که وضعیت opiA و CagA به هم مربوط می¬شود، این مشاهدات نیازمند مطالعات بیشتری است تا نقش opiA را در التهاب معده به وضوح شرح دهد. چون این ژن به تازگی کشف شده، اطلاعات زیادی در مورد نقش آن ومکانیسم بیماری¬زایی آن به عنوان یک فاکتور مشخص بیماری هنوز در دسترس نیست[83،84].

SabA(Hop P)-
پروتئین¬های میانجی SabA به اسید سیالیک حاوی Glycoconjugatesمتصل می¬شود. هلیکوباکتر پیلوری که باعث القا التهاب معده و کارسینوم معده می ¬شود با جای¬گیری آنتی ژن های Lewis Nonsialyated توسط آلل¬های Lex و sialyated Lea مرتبط می-باشند.
بنابراین SabA یک نقش احتمالی در التهاب مزمن ومراحل آتروفی دارد. گرانولوسیت¬های انسانی نیز در سطح خود کربوهیدرات¬های سیالیه شده را حمل می¬کنند، بنابراین متعاقب آن این سلول¬ها اختصاصاً توسطSabA شناسایی می¬شوند. در in vitroمتصل شدن هلیکوباکتر پیلوری با گرانولوسیت¬ها باعث فعالیت غیر اپسونیک این سلول¬ها می¬شود. این عمل اجازه می¬دهد، باکتری¬ها این سلول¬ها را کنترل کنند. به نظر می-رسد پروتئین SabA باعث باند شدن با پروتئین ماتریکس خارج سلولی به نام لامینین می-شود. این سلول¬ها در مراقبت¬های ایمنی نقش ندارند و این نکته به باکتری اجازه کنترل پاسخ ایمنی را می¬دهد [86].

1-11-2- تاژک
تاژک هلیکوباکتر پیلوری در یک قطب قرار گرفته و باعث تحرک شدید آن می¬شود. وجود غشا، فلاژل¬ها را از اثر اسید معده محافظت می¬کند و در یک قطب قرار گرفتن آن¬ها باعث حرکت پیچشی باکتری و در نتیجه نفوذ آن به لایه مخاطی می¬گردد[27]. تحرک از عوامل اصلی بقا وعفونت¬زایی هلیکوباکتر پیلوری است زیرا تحقیقات نشان داده اند که باکتری جهش یافته فاقد حرکت، قادر به ایجاد عفونت وجایگزینی در معده خوکچه هندی نیست[87].
هلیکوباکتر پیلوری برای اینکه به وسیله اسید معده و عوامل موجود در مخاط از بین نرود به سمت سطح سلول¬های پوششی که زیر مخاط قراردارد حرکت می¬کند تا در آن جا استقرار یابد. اهمیت تحرک در بیماری¬زایی آن جا شناخته می¬شود که می¬بینیم میزان تحرک سویه¬های هلیکوباکتر پیلوری باعفونت زایی در خوکچه هندی ارتباط دارد. تاژک از دو پروتئین فلاژلین مختلف ساخته شده است. اما در حدود 40 ژن اضافی در ترشح و مونتاژ کل دستگاه فلاژلار دخیلند. سیستم تحرک کموتاتیک جهت گیری فضایی باکتری را تعیین می¬کند.[88].

1-11-3- لیپوپلی ساکارید
اغلب سویه¬های هلیکوباکتر پیلوری می¬توانند LPS را بیان کنند، که حاوی آنتی ژن الیگوساکاریدی فوکوزیله شده هستند. این آنتی ژن¬های باکتریایی (آنتی ژن Lewis ) دارای تنوع آنتی ژنیک قابل ملاحظه¬ای هستند و تصور می¬شود در حمله¬های ایمنی شرکت می¬کنند. ابتدا تصور بر این بود که این¬ها سلول¬های میانجی ادهزین هستند اما در مطالعات بعدی مشخص شد که آنتی ژن¬های Lewis تنها نقش محدودی به عنوان ادهزین در کلونیزه شدن باکتری ایفا می¬کند. بیان آنتی ژن¬های Lewis باعث افزایش ورود باکتری به سلول اپیتلیال و القا پاسخ ایمنی ذاتی می¬شود. LPS باعث تحریک TNF-β و IL-8 هم در سلول¬های اپیتلیال وهم در سلول¬های سیستم ایمنی به روشی مستقل از cagA می-گردد[69].

1-12- سایر آنزیم¬های هلیکوباکتر پیلوری
1-12-1- کاتالاز
همانند سایر باکتری¬ها، آنزیم کاتالاز با تبدیل پراکسید هیدروژن به آب و اکسیژن، باکتری را دربرابر اثر مخرب پراکسید هیدروژن محافظت می¬کند. بنابراین به زنده ماندن باکتری در مخاط معده و احتمالاً در واکوئل¬های فاگوسیتیک کمک می¬کند. آنزیم کاتالاز هلیکوباکتر پیلوری دارای وزن مولکولی حدوداً 165 تا 200 کیلودالتون بوده. وزن مولکولی زیرواحدهای آن 50 تا 52 کیلودالتون است[89].

1-12-2- فسفولیپاز
باکتری توسط این آنزیم باعث تجزیه فسفولیپید¬های غشایی مانند فسفاتیدیل اتانول آمین شده در نتیجه باعث تخریب غشاء سلول¬های اپیتلیال و لایه مخاطی می¬گردد [90].

1-12-3- پروتئاز
همانند فسفولیپاز باعث تخریب و هضم غشاء سلول¬های اپیتلیال و لایه مخاطی می¬شود وبدین وسیله باعث افزایش سیالیت مخاط می¬گردد، این باکتری دارای سوپراکسیددیسموتاز و الکل دهیدروژناز نیز هست[90].

1-13- تظاهرات بالینی
بعد از جداسازی و کشت هلیکوباکتر پیلوری از نمونه¬های بیوپسی معده بیماران مبتلا به گاستریت توسط وارن و مارشال در سال 1983 و معرفی این باکتری بعنوان عامل اصلی گاستریت فعال مزمن، توجه بسیاری از محققین به این باکتری جلب شد و سالانه تحقیقات بسیار زیادی در این زمینه انجام می¬گیرد و هم اکنون ارتباط وجود این باکتری با وجود بیماری¬های مختلف دستگاه گوارش مانند سوء هاضمه بدون نشانه (NUD)، زخم معده، زخم دوازدهه، سرطان معده و لنفومای معده به اثبات رسیده است[45].

1-13-1-NUD) Non Ulcer Dyspepsia)
Non-ulcer dyspepsia به واسطه نشانه¬هایی شناخته می¬شود که نقصی را در دستگاه گوارشی فوقانی بدون بیماری ارگانیک قابل توجه نشان می¬دهد.NUD یکی از بیماری¬های بسیار متداول در بیماران است که در کلینیک¬های گوارشی پزشکان با آن روبرو می¬شوند. این نقص به 4 زیرگروه تقسیم شده است. دیسپپسیا شبیه ریفلاکس به وسیله استفراغ شناخته می¬شود. بیماران با دیسپپسیا مانند(dysmotility- like dyspepsia) بدحرکتی معده عمدتاً از تهوع، استفراغ وسیری شکایت می¬کنندکه احتمالاً این تیپ با مشکل حرکتی معده همراه است، به این معنی که تخلیه معده کند انجام می¬شود. دیسپپسیای شبیه زخم، توسط درد ناحیه اپی¬گاستر شناخته می¬شود. معمولاً به وسیله خوردن غذا و آنتی اسید بهبود می¬یابد [83].

1-13-2- زخم معده
شواهدی مبنی براین که عفونت با H. pylori عامل ایجاد زخم معده در تعداد زیادی از بیماران مبتلا به زخم معده است، وجود دارد. این زخم¬ها که فقط در معده وجود دارند در مقایسه با زخم دوازدهه از شیوع کمتری برخوردارند و گاهی عامل ایجاد این زخم¬ها مصرف داروهای ضدالتهاب غیراستروئیدی (NSAID) است.
میزان آلودگی با H.pylori در بیماران دارای زخم معده در حدود 70% است، مطالعات اخیر نشان می¬دهد که درمان عفونت H.pylori بطور مشخصی میزان عود زخم معده را کاهش می¬دهد [45].

1-13-3- زخم دوازدهه
شیوع عفونت هلیکوباکتر پیلوری در بیماران دارای زخم دوازدهه بیش از 95% است، در حالیکه درصد شیوع عفونت با این باکتری در موارد زخم 50% است. بنابراین ایجاد زخم دوازدهه بدون حضور H. pylori غیرمعمول است. در چنین موارد نادری عوامل دیگری مانند مصرف NSAID، بیماری Crohn یا سندرم Zollinger-Ellison در بهبود زخم دوازده دخالت دارند. مطالعات مربوط به درمان عفونت H. pylori و بهبود زخم دوازدهه اثبات کننده¬ی ارتباط این دو است.
مکانیسمی که بوسیله آن عفونت H. pylori زمینه را برای ایجاد زخم دوازدهه مستعد می¬کند به شرح ذیل است: در ابتدای بیماری با H. pylori فقط به مخاط ناحیه¬ی آنتروم معده محدود می¬شود و در طول سال¬های اول آلودگی، هیچ باکتری در دوازدهه دیده نمی-شود.
این نشان دهنده¬ی این مطلب است که زخم دوازدهه نمی¬تواند در اثرتهاجم و آسیب مستقیم باکتری به مخاط باشد[70]. زخم دوازدهه همیشه با ترشح فراوان اسید معده همراه است و مشخص شده است که عفونت H. pylori با تحریک ترشح اسید زمینه را برای ایجاد زخم فراهم می¬کند. مخاط آنتروم منبع هورمون گاسترین است که سلول¬های پرینال بدنه معده را برای ترشح اسید تحریک می¬کند. اگرمقدار اسید زیاد شود PH پایین شیره معده مانع از آزاد شدن بیشتر گاسترین می¬شود. این مهار آزاد شدن گاسترین با واسطه اسید از طریق آزاد شدن هورمون سوماتوستاتین از سلول¬هایD در کنار سلول¬ها یG تولید کننده گاسترین قرار دارند است. عفونت با H. pylori این تنظیم آندوکراین ترشح اسید را بهم می¬زند. در افراد آلوده با H. pylori مقدار گاسترین در هنگام مصرف غذا و همین طور موقع خالی بودن معده افزایش می¬یابد. درمان عفونت H. pylori منجر به عادی شدن ترشح اسید می¬شود و این نشان دهنده¬ی این حقیقت است که افزایش ترشح اسید به خاطر عفونت باکتریایی است.
تنها بخشی از افراد آلوده با H. pylori به زخم دوازدهه مبتلا می¬شوند و این می¬تواند بخاطر مقدار ترشح بیش ازاندازه اسید القاء شده بوسیله عفونت باشد. میزان افزایش گاسترین در بیماران دارای زخم دوازدهه و داوطلبان آلوده شده با باکتری مشابه است اما میزان افزایش ترشح اسید بخاطر افزایش گاسترین در بیماران دارای زخم بطور مشخص بیشتر است [91].
افزایش ترشح اسید بخاطر آلودگی با H. pylori منجر به تخریب مخاط دئودنوم می-گردد. در پاسخ به این تخریب و آسیب مخاط، بخش¬هایی از مخاط دئودنوم، به شکل مخاط متاپلاستیک تیپ معده¬ای تغییر شکل می¬دهند. این تغییر شکل به باکتری¬هایی که فقط می-توانند به مخاط تیپ معده¬ای متصل شوند اجازه می¬دهدکه در مخاط دئودنوم کلونیزه شوند و باعث آسیب موضعی در مخاط پوشاننده دئودنوم گردند. بنابراین هم در معرض ترشح زیاد اسید قرار می¬گیرد و هم در معرض آسیب مستقیم باکتری و سایتوتوکسین¬هایش قرار می¬گیرد. سرانجام این وقایع منجر به تخریب مخاط و تشکیل نواحی دارای زخم می¬شود. سویه¬هایی از H. pylori که cagA مثبت هستند بیشتر در بیمارانی که به زخم دوازدهه مبتلا می¬شوند دیده می¬شوند [45].

1-13-4- سرطان معده
سرطان معده دومین سرطان رایج در دنیا است. از آنجایی که هلیکوباکتر پیلوری عامل رایج ترین شکل گاستریت مزمن است و به خوبی مشخص شده است که گاستریت مزمن می¬تواند بعنوان یک فاکتور خطر برای ایجاد سرطان معده باشد، نقش این باکتری در ایجاد سرطان معده تایید می¬شود[35]. هلیکوباکتر پیلوری اولین عامل میکروبی است که رابطه ی آن با ایجاد سرطان مشخص شده است. بر اساس تحقیقات صورت گرفته افراد آلوده شده با این باکتری شش برابر بیشتر از افراد سالم دچار سرطان معده می¬شوند. ویژگی¬های اپیدمیولوژیک آلودگی با H. pylori شامل، افزایش شیوع درسنین بالا، شیوع بالاتر درسیاه پوستان و اسپانیائی تبارها، و شرقی¬ها، ارتباط با سطح پایین اقتصاد اجتماعی و همین طور زندگی در مکان¬های پرجمعیت است. افزون بر این گاستریت آتروفیک که فاکتور خطر برای سرطان معده است، با عفونت توسط هلیکوباکتر پیلوری هم درارتباط است. بنابراین نقش مستقیم عفونت با این باکتری و ایجاد سرطان معده از نظر زیست شناسی هم قابل قبول است، و کشورهایی که میزان عفونت با هلیکوباکتر پیلوری در آن¬ها بالاست، میزان شیوع سرطان معده بالاتری هم دارند[45].
گذشته از آن چه در مورد اثر مستقیم هلیکوباکتر پیلوری در ایجاد سرطان گفته شد پاسخ¬های ایمنی علیه این باکتری نیز در روند سرطان¬زایی نقش بسزایی دارند. تحریک مزمن و مداوم سیستم ایمنی توسط هلیکوباکتر پیلوری موجب تولید پیوسته مقادیر بالایی از رادیکال¬های آزاد اکسیژن و نیتروژن توسط ماکروفاژها، مونوسیت¬ها و نوتروفیل¬ها می-گردد. نیتریک اکسید یا NO تولید شده توسط این سلول¬ها افزون بر عملکرد ایمنی به طور مستقیم در فرایند سرطان¬زایی اثر می¬گذارد. NO از سویی باعث آسیب رساندن به ساختمان ژنی سلول¬های پوششی معده شده و از سوی دیگر سیستم¬های ترمیم DNA را در این سلول¬ها غیر فعال می¬کند به این ترتیب میزان جهش در سلول¬ها به شدت افزایش پیدا می-کند. آپوپتوزیس به عنوان فرایند حذف کننده سلول¬های خطرناک مسئولیت از بین بردن این سلول¬ها را به عهده دارد. NO با نیتروزیلاسیون مسیرهای آپوپتوزیس روند آن را مختل می¬کند تا آخرین سد دفاعی بدن برای حذف سلول¬های تغییر شکل یافته بی¬اثر گردد[51].
هلیکوباکتر پیلوری باعث ایجاد یک فرآیند التهابی مزمن در زیر مخاط می¬شود. این فرآیند هم می¬تواند باعث افزایش دگرگونیDNA در سلول¬های مخاطی شود و هم می-تواند باعث تولید رادیکال¬های آزاد بوسیله سلول¬های التهابی گردد. این رادیکال¬های آزاد می¬توانند باعث وارد شدن آسیب به DNA شوند بخصوص در فاز تقسیم که DNA حساسیت زیادی دارد، آسیب وارد شده می¬تواند باعث جهش در DNA شود که این خود سرانجام ممکن است منجر به نئوپلازی شود.
عفونت با هلیکوباکتر پیلوری ترشح فعال ویتامین C به درون شیره معده را برهم می¬زند. درافراد سالم غلظت ویتامین C در شیره معده پنج تا ده برابر غلظت آن در سرم است. به هرحال در حضور عفونت، این غلظت بطور مشخصی کاهش می¬یابد بطوری که غلظت آن به حد غلظت سرم می¬رسد. ویتامین C احتمالاً بخاطر خاصیت آنتی¬اکسیدانش می¬تواند از ایجاد سرطان معده جلوگیری کند. بنابراین کاهش ویتامین C در معده بخاطر عفونت می-تواند وارد شدن آسیب به DNA را به وسیله رادیکال¬های آزاد تسهیل کند. یک فاکتور مهم مستعد کننده برای ایجاد سرطان معده که از مدت¬ها قبل شناخته شده است، کاهش یا فقدان ترشح اسید معده است. مکانیسمی که بوسیله آن کاهش یا فقدان اسید معده منجر به سرطان معده می¬شود بخوبی شناخته نشده است ولی احتمالاً بخاطر کلونیزه شدن معده¬های فاقد اسید باگونه¬هایی از باکتری¬های مولد نیتروزآمین و تشکیل نیتروزآمین است[92].

1-14- تشخیص
تست¬های متعددی برای تشخیص عفونت هلیکوباکتر پیلوری در دسترس است. این تست¬ها را می توان به دوگروه تقسیم کرد:
1-تست¬های تهاجمی (Invasive) که انجام آن¬ها نیازمند به آندوسکوپی و گرفتن بیوپسی از معده بیمار است .
2-تست¬های غیر تهاجمی (Non Invasive) برای انجام آن¬ها نیازی به بیوپسی نیست.

1-14-1-روش سریع اوره آز یا RUT (Rapid urease test)
این روش بر اساس فعالیت آنزیم اوره¬آز هلیکوباکتر پیلوری در نمونه بیوپسی است که سوبسترای اوره را در حضور یک معرف رنگی فنل رد به آمونیاک و دی اکسید کربن تبدیل می¬نماید.
NH2-CO-NH2 + H2O → CO2 + 2NH3
NH3 + H2O → NH4
با افزایش PH توسط آمونیاک و در نتیجه تغییر رنگ معرف، وجود هلیکوباکتر پیلوری تشخیص داده می¬شود. تست¬هایی بر این اساس با نام¬های تجاریCLOtest, HpFast ، PyloriTek, CPtest, EndoscHp قابل دسترس هستند. مشخص شده که حساسیت و ویژگی این روش ها به ترتیب 95-85 ٪ و100-95٪ است [93]. این روش در مقایسه با سایرروش¬های تهاجمی سریع¬تر و ارزان¬ترقابل انجام است.

1-14-2- کشت (Culture)
در این روش، نمونه بیوپسی در شرایط میکرو آئروفیلیک (اتمسفر حاوی 5% ودی اکسید کربن 5-10% در محیط¬های اختصاصی Brucella blood agar حاوی وانکومایسین (vancomycine) ، پلی میکسین(B polymixin) و تری متوپریم (trimethoprim) به مدت 3 تا 5 روز در دمای 37 درجه سانتیگراد کشت داده می¬شود وسپس کلونی¬ها به وسیله رنگ آمیزی گرم (Gram stain) و تست¬های بیوشیمیایی نظیر اکسیداز، اوره¬آز و کاتالاز مورد بررسی قرار می¬گیرد. کشت هلیکوباکتر پیلوری اثبات قطعی آلودگی به این باکتری بوده، اما توانایی جداسازی هلیکوباکتر پیلوری از نمونه¬های بیوپسی وابسته به امکانات و تجربه آزمایشگاه¬ها است و به همین دلیل برای این روش حساسیت متفاوتی گزارش می¬گردد. اما ویژگی این روش 100% بوده و اکثر تحقیقات برای این روش حساسیت کمتر از 100% و اما بیشتر از 90% رادر نظر گرفته اند[93].

1-14-3- بافت شناسی(Histology)
بافت شناسی، نخستین روش برای تشخیص هلیکوباکتر پیلوری بوده وبه وسیله مارشال و وارن ابداع گردیده است. این روش بر مبنای رنگ آمیزی¬های مختلف بیوپسی بوده و در آن دو هدف اصلی دنبال می¬گردد. نخست مشاهده مستقیم هلیکوباکتر پیلوری و دوم، بررسی تغییرات شکل (Morphologic) بافت معده، ناشی از وجود این باکتری است. بنابراین بافت شناسی تنها روشی است که می¬تواند هم هلیکوباکتر پیلوری را شناسایی کند و هم آسیب¬های ناشی از این آلودگی را آشکار ¬سازد[94]. روش¬های رنگ آمیزی زیادی وجود دارد که شامل وارتین – استاری، هماتوکسیلین– ائوزین، جنتا تولوئیدن آبی ، رومانوسکی و رنگ آمیزی¬های ایمنی– شیمی است اما رایجترین آن¬ها روش گیمسا(staining Giemsa ) بوده است[93]. مطالعات نشان می¬دهد وقتی باکتری وجود داشته باشد با بررسی دقیق آن با این روش، می¬توان آن را تشخیص داد و هیچ کدام از رنگ آمیزی¬ها بر دیگری ارجح نیستند ولی با این حال حساسیت بافت شناسی را عموماً 90-95% و ویژگی آن را 98-95 ٪ می¬دانند[31،41].

1-14-4- روش¬های ملکولی (Molecular methods)
این روش¬ها اصولاً بر پایه واکنش زنجیره¬ای پلیمراز( PCR)و بر مبنای تشخیص قسمتی از ژنوم هلیکوباکتر پیلوری در نمونه¬های بیوپسی است. بر این اساس روش¬های مختلف PCR نظیر Real time PCR ، RFLP-PCR ، Nested PCR بنا شده است. مزیت این روش بر سایر روش¬های بر اساس بیوپسی آن است که به وسیله این روش می¬توان ژن-های اختصاصی دیگر را در هلیکوباکتر پیلوری تشخیص داد، به ویژه ژن¬هایی که نقش مهمی در بیماری¬زایی این باکتری دارند، و همچنین به وسیله این روش می¬توان ژن¬های مرتبط با مقاومت این باکتری با آنتی بیوتیک¬ها را شناسایی کرد [95].
در روش PCR برای تشخیص هلیکوباکتر پیلوری از ژن¬های مختلفی نظیر S 16 rRNA، S 23 rRNA ژن¬های زیرواحدهای A،B و C اوره¬آز، ژن¬های CagA و Vac A و flaA و پروتئین شوک حرارتی (HSP) جهت طراحی پرایمر¬ها استفاده شده است. محققین حساسیت و ویژگی¬های PCR را به ترتیب 2/93 % و 2/96 % محاسبه نموده-اند[93]. این تکنیک در اواسط دهه 1980 بوسیله کری مولیس معرفی شد. به دلیل کاربردها و مزیت¬های بسیار زیاد آن به سرعت در زیست شناسی مولکولی گسترش پیدا کرد. امروزه این روش تقریباً در تمامی آزمایشگاه¬های زیست شناسی مولکولی جزء کارهای متداول است و به صورت اتوماتیک به وسیله کامپیوترانجام می¬شود. PCR از نظر اصول عملی تشابه زیادی به همانند سازی DNA دارد و در واقع برگرفته از آن است. DNA پلی¬مراز DNA ،تک رشته¬ای را از جهت΄ 5 به΄ 3 به عنوان الگو مورد استفاده قرار می دهد و رشته مکمل را در جهت΄ 3 به΄ 5 می¬سازد. همچنین DNA پلی¬مراز برای شروع احتیاج به یک قطعه اولیه دارد. برای انجامPCR، DNA پلی¬مراز، نوکلئوتید تری فسفات و پرایمر لازم هستند. از آنجایی که DNA دورشته¬ای است، دو نوع پرایمر در PCR مورد نیاز است. این دو پرایمر دو عمل انجام می¬دهند، اول اینکه محل ژنی که باید تکثیر شود را مشخص می-نمایند و دوم اینکه اندازه قطعات تکثیر شونده را تعیین می¬کنند. عمل اول کاملاً مشخص است، در مورد عمل دوم باید گفت که وقتی این دو پرایمر به دو ناحیه مختلف DNA و به سمت هم قرار می¬گیرند DNA پلی¬مراز تنها قطعات را در بین این دو ناحیه همانند سازی می¬کند و به این ترتیب طول قطعات ساخته شده تعیین می¬شود [91].
جهت تشخیص هلیکوباکتر پیلوری به روش PCR از نمونه¬های غیر بیوپسی نظیر بزاق، پلاک¬های دندانی و نمونه¬های مدفوع نیز استفاده شده است اما نتایج مطلوبی در استفاده از نمونه¬های اخیر بدست نیامده است.
امروزه به دلیل این که تکنیک PCR پر زحمت و گران است بیشتر در کارهای تحقیقاتی بکار گرفته می¬شود، به نظر می¬رسد در آینده نزدیک بتوان جایگاه مناسبی به عنوان یک تست روتین آزمایشگاهی در تشخیص آلودگی هلیکوباکتر پیلوری قرار گیرد[93].

مطلب مرتبط :   داستان، ، صیاد، آهو، کودک

1-14-5-روش¬های غیر تهاجمی
این روش¬ها جهت تشخیص هلیکوباکتر پیلوری از نمونه¬های خونی، تنفسی، ادراری، بزاقی و مدفوع بیمار استفاده می¬شود. در واقع دو نوع متفاوت از این روش¬ها وجود دارد: مستقیم(Direct) و غیر مستقیم (Indirect). تست¬های مستقیم همانند تست¬های تهاجمی در جستجوی شواهد مستقیم وجود هلیکوباکتر پیلوری هستند بنابراین آن¬ها قادرند وجود باکتری زنده را در افراد تشخیص دهند به همین دلیل به آن¬ها تست¬های فعال نیز گفته می-شود نظیر تست آنتی ژن مدفوعی، که وجود آنتی¬ژن¬های باکتری را مدفوع تشخیص می-دهد و یاتست تنفسی اوره که فعالیت آنزیم اوره¬آز این باکتری را مورد ارزیابی قرار می-دهد، اما تست¬های غیر مستقیم با ارزیابی شواهد غیر مستقیم مانند وجود آنتی¬بادی¬ها برضد هلیکوباکتر پیلوری در سرم، ادرار یا بزاق فرد، آلودگی به هلیکوباکترپیلوری را تشخیص می¬دهند[59].

1-14-5-1- روش تنفسی اوره یا UBT (Urea breath test)
این روش نخستین روش غیرتهاجمی در تشخیص هلیکوباکتر پیلوری است که در سال 1987 ارائه شد. دقیق¬ترین روش غیرتهاجمی در تشخیص این باکتری محسوب می¬شود و بر اساس فعالیت آنزیم اوره¬آز هلیکوباکتر پیلوری استوار است بنابراین قادر است عفونت فعال را تشخیص دهد.
در صورت وجود این باکتری، اوره نشاندار به شکل C14 یا C13 ، خورده شده توسط بیمار به دی اکسید کربن وآمونیاک هیدرولیز می¬گردد. دی اکسید کربن نشاندار پس از جذب خون، از طریق دستگاه تنفسی در هوای بازدمی دفع خواهد شد که قابل رد¬یابی وتشخیص توسط دستگاه¬های شمارشگر یا اسپکترومترجرمی است حساسیت و ویژگی این تست به ترتیب 97% و95% در اکثر مطالعات به دست آمده است [90].

1-14-5-2- روش_های بر اساس آنتی¬بادی
پس از کلونیزاسیون معده توسط هلیکوباکتر پیلوری سیستم ایمنی میزبان تحریک شده ویکی از پاسخ¬های آن تولید آنتی¬بادی بر علیه آنتی¬ژن¬های باکتری است. روش¬های بر اساس آنتی¬بادی که روش¬های ایمنولوژیک نامیده می¬شوند، برمبنای تشخیص آنتی¬بادی¬های اختصاصی IgG، IgA وIgM علیه آنتی¬ژن¬های هلیکوباکتر پیلوری در خون، ادرار و یا بزاق بیمار است. بر این اساس از چند روش از تکنیک¬های مختلف بیوشیمیایی که در دسترس قرار گرفته¬اند بهره می¬گیرند که عبارتند از: الایزای منظم (Regular ELISA)، سنجش¬های ایمنوبلانت ( immunoblot¬Assay)، ¬ایمنوکروماتوگرافی (Immuno chromatography)، روش¬های آنتی¬ژنی مدفوع) Stool antigen tests) [94].

1-15- درمان:
هلیکوباکتر پیلوری در شرایط آزمایشگاه حساسیت بالایی به دامنه¬ی وسیعی از آنتی-بیوتیک¬ها مانند: آنتی¬بیوتیک¬های بتالاکتام، ماکرولیدها، مترونیدازول و تینیدازول، نیتروفوران¬ها، جنتامایسین، تتراسایکلین¬ها و کینولون¬های جدید دارد[4]، اما درمان هلیکوباکترپیلوری، بخاطر جایگاه ویژه¬اش در مخاط معده مشکل است. اکثر مواد ضدمیکروبی در محیط اسیدی معده غیر فعال می¬گردند و به مقدار کمی به داخل مخاط معده نفوذ می¬کنند. باکتری همچنین به ترکیبات بیسموت مانند بیسموت ساب سیترات و ساب سالسیلات حساس است[39]. بطوری که حداقل غلظت مهار کننده (MIC) بیسموت برای این باکتری بسیار کمتر از غلظتی است که با مصرف خوراکی بیسموت در مخاط معده فراهم می¬شود. در عین حال، این حساسیت آنتی¬بیوتیکی باکتری در آزمایشگاه تایید و تضمین کننده حساسیت باکتری نسبت به این آنتی¬بیوتیک¬ها در بدن نیست[45].
اصول شیمی درمانی هلیکوباکتر پیلوری که براساس مطالعات وسیع در زمینه درمان این باکتری بدست آمده اند عبارتند از:
1- درمان با یک دارو منجر به کاهش ظاهری ارگانیسم¬ها در تعداد کمی از بیماران می-شود، در نتیجه در اکثر رژیم¬های درمانی مفید از چند دارو بطور همزمان برای درمان استفاده می¬شود [5].
2- بعضی از داروهای ضد میکروبی که در آزمایشگاه قادر به از بین بردن باکتری هستند، در بدن حتی وقتی به همراه داروهای دیگر مصرف می¬شوند، بر روی باکتری اثری ندارند. اریترومایسین مثال خوبی برای این پدیده است. غیرفعال شدن اکثر آنتی¬بیوتیک¬ها در PH اسیدی می¬تواند دلیل عدم تاثیر آنها بر باکتری در بدن باشد [12].
3- مقاومت اکتسابی غالباً پس از درمان با برخی از آنتی¬بیوتیک¬ها ایجاد می¬شود. میزان مقاومت اکتسابی نسبت به کینولون¬ها بقدری زیاد است که مصرف آن¬ها را محدود کرده است. مقاومت ثانویه به ایمیدازول¬ها در 10 تا 30 درصد موارد، حتی زمانی که همراه سایر داروها مصرف می¬شوند، رخ می¬دهد. همچنین ظهور مقاومت نسبت به ماکرولیدها و ریفامپین گزارش شده است [45].
4- برای این که مشخص شود که ارگانیسم واقعاً از بین رفته است و یا این که فقط بطور موقت مهار شده است بایستی بیمار را از نظر وجود باکتری بررسی کنیم. اگر می¬خواهیم از تست¬های تهاجمی برای تشخیص استفاده کنیم نمونه بیوپسی بایستی حداقل یک ماه پس از قطع درمان گرفته شود. برای انجام تست¬های غیرتهاجمی مانند تست¬های سرولوژی یا اوره-آز تنفسی هم بایستی یک ماه از قطع درمان گذشته باشد [45].
پنج رژیم درمانی برای درمان عفونت هلیکوباکتر پیلوری به تصویب سازمان غذا و داروی ایالات متحده آمریکا (FDA) رسیده است. در سه رژیم از این پنج رژیم برای درمان از دو دارو استفاده می¬گردد. در دو رژیم دیگر از سه دارو برای درمان استفاده می-گردد. اگرچه با استفاده از درمان دوگانه بهبودی در بیش از 70% موارد حاصل می¬گردد اما با استفاده از درمان سه گانه میزان بهبودی به بیش از 90% موارد می¬رسد [5]. داروهای مورد استفاده در رژیم¬های دوگانه عبارتند از:
– رژیم اول: امپرازول و کلاریترومایسین
– رژیم دوم: رانیتیدین، بیسموت سیترات، کلاریترومایسین
– رژیم سوم: لانسوپرازول و آموکسی سیلین
میزان بهبودی در رژیم اول 70 تا 75 درصد، برای رژیم دوم 73 تا 84 درصد و برای رژیم سوم کمتر از 50% در مطالعات انجام شده در آمریکا است. به دلیل کفایت کم این رژیم¬ها در درمان، از رژیم درمانی سه گانه که بین 85 تا 95 درصد بهبودی حاصل می¬شود استفاده می¬گردد. هم اکنون درمان سه گانه بعنوان استاندارد طلایی برای درمان هلیکوباکتر پیلوری شناخته می¬شود. رژیم¬های درمانی سه گانه که معمولاً برای درمان استفاده می¬شوند عبارتند از:
– رژیم اول: املاح بیسموت+ مترونیدازول+ آموکسی سیلین یا تتراسایکلین
– رژیم دوم: املاح بیسموت + کلاریترومایسین+ آموکسی سیلین یا تتراسایکلین
لازم بذکر است بیمار بایستی به همرا داروهای تجویز شده در این دو رژیم از یک مهار کننده اسید مانند رانیتیدین و فاموتیدین که آنتاگونیست رسپتور H2 می¬باشند هم استفاده کند.
– رژیم سوم: امپرازول یا لانسوپرازول + کلاریترومایسین + مترونیدازول
– رژیم چهارم: امپرازول یا لانسوپرازول + کلاریترومایسین + آموکسی سیلین
معمولاً طول دوره ی درمان در هر یک از این رژیم¬ها چهارده روز است. املاح بیسموت که در بعضی از رژیم¬های درمانی سه گانه تجویز می¬گردد هم نقش محافظت از مخاط معده را دارد و هم دارای اثر ضد باکتریایی است [46].
اثر ضد باکتریایی بیسموت بر هلیکوباکتر پیلوری بصورت ورود مقادیری از آن باکتری و تجمع آن در زیر دیواره سلولی و انفجار ارگانیسم است. از طرف دیگر مقدار زیادی از بیسموت بطور انتخابی به سطح خارجی دیواره سلولی و فلاژل¬ها می¬چسبد که این باعث تغییر PH اطراف باکتری می¬گردد [39].
املاح بیسموت بخصوص کولوئیدال بیسموت ساب سیترات با اتصال به موسین معده یک کمپلکس بیسموت –گلیکوپروتئین ایجاد می¬کند که به مخاط آسیب دیده می¬چسبد و انتشار یون هیدروژن را کند می¬کند. این ترکیب همچنین باعث افزایش پروستاگلاندین E2 و غلظت بی¬کربنات می¬گردد در حالیکه غلظت فاکتورهای تهاجمی موضعی مانند لکوترین C4 و پپسین را کاهش می¬دهد[4] مهارکننده¬های پمپ پروتون از جمله داروهایی هستند که در رژیم درمانی سه گانه استفاده می¬شوند.
مهارکننده¬های پمپ پروتون مانند امپرازول و لانسوپرازول و پانتوپرازول (جدیدترین داروی این دسته) با مهار H+، K+ ATPase در سلول¬های پریتال معده، اثر ضد اسیدی قوی را القاء می¬کنند. افزون بر مهار بقاء هلیکوباکتر پیلوری در PH خنثی در آزمایشگاه، این داروها توانایی باکتری را برای زنده ماندن در PH اسیدی در آزمایشگاه کاهش می-دهند و همچنین بطور انتخابی فعالیت اوره¬آز باکتری را مهار می¬کنند. مکانیسم دقیق فعالیت ضد هلیکوباکتری امپرازول در Invivo بخوبی شناخته نشده است. مفیدبودن اکثر آنتی-بیوتیک¬ها (مانند آموکسی سیلین) در PH خنثی یا نزدیک خنثی تشدید می¬گردد و بنابراین یکی از اثرات سودمند امپرازول می¬تواند ویژگی ضد ترشحی قوی این دارو باشد که آزاد شدن یا کفایت سایــر آنتی¬بیوتیک¬ها را افزایش می¬دهد. مطالعات انجام شده نشان دهنده¬ی این مطلب است که باکتری با تداخل با امپرازول می¬تواند باعث افزایش مهار پمپ پروتون در سلول¬های پریتال معده شود. در واقع اینکه اسیدهای چرب ایجاد شده توسط هلیکوباکتر پیلوری فعالیت H+,K+ ATP-ase را در آزمایشگاه مهار می¬کنند، مطلب بالا را تایید می-کند[94].

1-16- مقاومت آنتی¬بیوتیکی باکتری:
یکی از شاخص¬های موفقیت در درمان، حساسیت باکتری به آنتی¬بیوتیک تجویز شده است. به عبارت دیگر مقاومت باکتری به دو آنتی¬بیوتیک اصلی (مترونیدازول و کلاریترومایسین) مورد استفاده در رژیم¬های درمانی دلیل اصلی شکست درمان است. مقاومت به مترونیدازول خیلی رایج بوده ودرصد فراوانی سوش¬های مقاوم به مترونیدازول بین 10 تا 90درصد است. در حالی که میزان مقاومت به کلاریترومایسین بین 5 تا 10 درصد است. شیوع سویه¬های مقاوم از یک کشور به کشور دیگر فرق می¬کند و در مورد مترونیدازول در قسمت¬هایی از جهان که مترونیدازول و یا داروهای خویشاوند آن مانند تینیدازول برای درمان بیماری¬های تک یاخته¬ای مصرف می¬شود، سویه¬های مقاوم بیشتر است[80].

هدف ازانجام این مطالعه تعیین پلی¬مورفیسم موتیف¬های EPIYA در ژن CagA ایزوله¬های هلیکوباکترپیلوری جدا شده از بیماران مبتلا به بیماری¬های گاسترودئودنال و شناسایی ژنوتیپ¬های cag آن¬ها است.

فصل دوم:

مروری بر تحقیقات انجام شده

2-1- مروری بر مطالعات پیشین
ساتومی و همکاران در سال 2006 رابطه بین CagA و نتایج بالینی در اوکیناوای ژاپن را بررسی کردند.24 بیمار شامل 13بیمار مبتلا به سرطان معده و 11 بیمار مبتلا به زخم دوازدهه مورد مطالعه قرارگرفتند. ژن CagA توالی¬یابی و آنالیز شد تمام ایزوله¬ها CagA مثبت بودند و شیوع سویه¬های CagA مثبت شرق آسیا به طور قابل توجهی در بیماران با سرطان معده (84%)بیشتر بود [25].
گاتی و همکاران در برزیل در سال 2006 شیوع ژن CagAدر بیماران گوارشی آلوده به هلیکوباکتر پیلوری4/73 ٪ گزارش کردند و نشان دادند CagA ژنوتیپ غالبی است که منجر به زخم پپتیک می¬شود[76].
شیرازی و همکاران در سال 1387 در تهران، 180 بیمار را مورد مطالعه قرار دادند که از میان 120 بیماری که هلیکو باکتر پیلوری از آنها جدا شد، 81 بیمار دچار سوء ¬هاضمه بدون زخم، 17 بیمار دچار زخم گوارشی و 22 بیمار مبتلا به سرطان معده بودند. در بین 120 سویه مورد بررسی 101 سویه (2/84٪) CagA مثبت و 19 سویه باقیمانده (8/15) CagA منفی بودند [52].
جعفری و همکاران در سال 2007 طی تحقیقاتی 167 بیمار VH را مورد بررسی قرار دادند که 33 مورد دچار زخم معده، 129 مورد دچار سوء هاضمه و 5 مورد سرطان معده داشتند، از این تعداد 96 مورد (7/68٪) به هلیکو باکتر پیلوری آلوده بودند. در این برررسی نشان داده شد که ژن CagA در 76٪ موارد مثبت بوده است [35].
ویدال و همکاران در سال 2008 در پژوهشی که بر روی 30 بیمارگوارشی با گرفتن نمونه¬های بیوپسی معده آن¬ها انجام دادند مشخص کردند که در این نمونه ها، CagAیکی از مهمترین فاکتور¬های بیماری¬زایی بود. در بین بیماران (38٪)16 بیمار مبتلا به سرطان و (26٪) 14 مورد نیز دارای سوء هاضمه بودند[62].
در سال 2008 صالحی و همکاران روی 128 مورد بیمار مبتلا به بیماری¬های گاسترودئودنال مطالعه¬ای انجام دادند. در مجموع 95٪ بیماران دچار زخم دئودنال، 86٪ زخم معده و 66٪ دچار گاستریت بودند. نشان داده شدکه ژن cagA در 107 مورد (6/83٪) مثبت بوده است. میزانCagA در بیماران مبتلا به زخم دئودنال، زخم معده و گاستریت به ترتیب: 80٪ ، 77٪ و 46٪ بود[87].
دبیری و همکاران در سال 2010 در پژوهشی، ژنوتیپ¬های هلیکوباکتر پیلوری در 70 مورد از بیماران ایرانی و افغانی را بررسی نمودند (55 ایرانی و 15 افغان ).آن¬ها نشان دادند که 67 درصد هلیکوباکتر پیلوری¬های جدا شده از بیماران ایرانی و 60٪ هلیکوباکتر پیلوری¬های جدا شده از بیماران افغانی دارای ژن CagA بودند[93].
در سال 2010 سیلوا در برزیل میزان ژن¬های بیماری¬زای هلیکوباکتر پیلوری را در 40 بیمار مورد بررسی قرار داد و به این ترتیب: ژن CagA را به میزان 5/97% از بیماران جداسازی و گزارش کرد[65].
بن منصور و همکاران در سال 2010 شیوع ژنوتیپ های CagA هلیکوباکتر پیلوری را در بیماران تونسی مورد بررسی قرار دادند و گزارش کردند ژن CagAدر 6/61 درصدایزوله¬ها شناسایی شده [81].
در سال 2010 بیانوا و همکاران میزان شیوع ژنوتیپ های ژن CagA را مورد بررسی قرار دادند آن¬ها نشان دادند که در 196 بیماری که آلوده به هلیکوباکتر پیلوری بودند ژن CagA در 5/88٪ موارد مثبت بود[95].
هیرای و همکاران در سال 2011 توالی¬های جدا شده از ناحیه ΄3 ژن CagA هلیکوباکتر پیلوری در اشخاص سالم یا بدون نشانه بیماری در ژاپن و تایلند را با بیماران مبتلا به سرطان معده آنالیز و مقایسه کردند. بررسی توالی¬های CagA در 21 و 12 نمونه DNA هلیکوباکتر پیلوری به دست آمده از افراد ژاپنی وتایلندی توسط روش فیلوژنی ملکولی نشان داد که توالی¬ها در افراد تایلندی نسبت به افراد ژاپنی حفاظت شده¬تر بودند [24].
دورقی و همکاران در سال 1387 ،180 بیمار دچار اختلالات گوارشی را مورد مطالعه قرار دادند که 120 سویه هلیکوباکتر پیلوری از 180 بیمار مورد بررسی جدا شدند که از این میان 101 سویه CagA مثبت بودند و 19 سویه باقیمانده CagAمنفی و تمام بیماران دچار سرطان، CagA مثبت بودند[27].
کورتس و همکارانش در سال 2010 ویژگی¬های پروتئین CagA و ژن CagA در سویه¬های هلیکوباکتر پیلوری جدا شده از بیماران فلیپینی و مقایسه آن¬ها با سویه¬های منتشر در جهان و منابع مرجع قبلی را مورد بررسی قرار دادند. توالی ژن CagA 19 ایزوله فیلیپینی و رابطه فیلوژنی بین 40 سویه مرجع بررسی شد همه¬ی سویه¬های هلیکوباکتر پیلوری فیلیپینی CagA مثبت بوده و 37% سویه¬ها CagA مثبت نوع غربی بودند[11].
اسمیت و همکاران در سال 2010 فراوانی CagA در خصوص تعداد، رده والگوی موتیف¬های EPIYA را در سه گروه قومی بزرگ در جمعیت¬های مالزی و سنگاپور در رابطه با توسعه بیماری بررسی کردند. هلیکو باکتر پیلوری جدا شده از 49 بیمار هندی و 14 مالزیایی با سوءهاضمه (FD) و21 نفر مبتلا به سرطان معده (GC) با استفاده از PCR حضور CagA و تعداد و الگوی موتیف¬های EPIYA مورد بررسی قرار گرفته شدند. مجموع 126 ایزوله دارای CagA با بالاترین رمزدهی EPIYA-A و EPIYA-B (6/97%) بودند. درحالی که CagA 93% ایزوله¬های FD هندی EPIYA-C را به عنوان سومین موتیف رمزدهی می¬کردند. 91 % ایزوله های FD چینی و 81% ایزوله¬های GC هندی EPIYA-D را رمزدهی می¬کردند. در ایزوله¬های FD مالزیایی 61% و 38% به ترتیب دارای EPIYA-Cو EPIYA-D بودند بیشتر ایزوله¬ها دارای 3 موتیف EPIYA بودند اگرچه ایزوله¬های هندی به طور قابل توجهی 4یا بیشتر داشتند [29].
باتیستا و همکاران در سال 2011 رابطه بین الگوهای EPIYA، CagA در هلیکوباکتر پیلوری و سرطان معده و التهاب دوازدهه را در یک جمعیت غربی دورگه برزیل بررسی کردند. EPIYA CagA از مجموع 436 بیمار شامل 188 نفر مبتلا به سرطان معده، 112 نفر مبتلا به زخم دوازدهه و136 نفر با التهاب معده توسطPCR تعیین توالی شدند و مشخص شد که تعداد قطعات EPIYA-C به طور قابل توجهی با افزایش خطر کارسینومای معده در ارتباط است. دربیماران مبتلا به سویه¬های دارای یک یا بیشتر قطعه EPIYA-C کاهش سطح سرم پپسینوژن I بیشتر است[30].
کویریکا و همکاران در سال2010، EPIYA ناحیه ΄3 را با استفاده ازPCR در 93 سویه هلیکوباکتر پیلوری CagA مثبت از 49 بیمار مبتلا به التهاب معده،17بیمار مبتلا به سرطان معده و 24 بیمار مبتلا به زخم دوازدهه کلمبیایی مورد آنالیز قرار دادند. مشخص شد که سویه¬های با یک EPIYA-C در بیماران مبتلا به التهاب معده وزخم دوازدهه یافت شده و سویه¬های با سهEPIYA-C به طور عمده در بیماران با سرطان معده مشاهده شدند [31].
سیسینچی و همکاران در سال 2010 رابطه بین EPIYA و موتیف¬های CM و آسیب¬های معده در بیماران کلمبیایی مبتلا به عفونت هلیکوباکتر پیلوری از نواحی با خطر بالا و نواحی با خطر پایین به سرطان معده (GC) مورد آزمایش قرار دادند.DNA ژنومی از سویه¬های هلیکوباکتر پیلوری کشت شده از بیوپسی معده 80 بزرگسال با علایم اختلال گوارش استخراج شد. مشخص شد که 67 سویه (8/83%) از 80 سویه CagA مثبت بودند و پروتئین¬های CagA شامل یک (2/64%) دو (34%) و یا سه (5/1%) موتیف EPIYA-C با توالی اختصاصی CagA نوع غربی بودند. وسویه¬های با چندین موتیف EPIYA-C بیشتر با آسیب¬های شدید معده در ارتباط بودند [32].

فصل سوم:

مواد و روش¬ها

مواد و دستگاه¬های مورد نیاز:
3-1-1 مواد لازم جهت کشت میکروبی:
محیط کشت کلمبیا آگار
محیط انتقالی BHI براث + گلیسرین
محیط اوره براث
فیلتر45/. میکرومتری
آنتی¬بیوتیک¬های مورد نیاز: تری متوپریم، وانکومایسین و آمفوتریسین B

3-1-2- وسایل لازم جهت کشت میکروبی:
انکوباتور binder
اتو¬کلاو MEDEXPORT – روسیه
ترازوی دیجیتالی حساس و نیمه حساس
میکروسکوپ OLYMPUS(دو چشمی ) – ژاپن
جار بی هوازی شیمی گستر– ایران
اسلاید شیشه ای
پنس
پلیت یکبار مصرف پلاستیکی – ایران
ظروف شیشه ای: بشر، ارلن، استوانه مدرج پیرکس در اندازه¬های مختلف
سواب
چراغ گاز سوز
گاز پک (Gas pack )نوع C- Merck- آلمان

3-2 -وسایل ومواد لازم برای آزمایش¬های مولکولی:
( استخراج DNA،PCR و الکترو فورز )

3-2-1- مواد لازم جهت آزمایش های مولکولی:
Tris Hcl- Merck – آلمان
کیت استخراج DNA، Cina pure
Nacl–Merck_ آلمان
اسید بوریک– سیناژن
EDTA- سیناژن
اتیل الکل مطلق –Merck- آلمان
PCR buffer 10x
Mgcl2 25mM
dNTP 10 mM
Taq DNA polymerase 5 u/ML- سینا کلون – ایران
پرایمرcag A
Fermentas -100 bp DNA Ladder- سینا کلون- ایران
اتیدیوم بروماید سیناژن – ایران
Loading Buffer سیناژن– ایران
آگاروز(Molecular grade) سیناژن – ایران

3-2-2- وسایل لازم جهت آزمایش ¬های مولکولی
سمپلر 10-1 میکرو لیتری
سمپلر100-10 میکرو لیتری
سمپلر 1000-100 میکرو لیتری
سر سمپلر های کریستالی – زرد وآبی
PH متر –Corning
میکرو سانتریفیوژ- Hettich- آلمان
دستگاه ترموسایکلر- BIO-RAD- آلمان
تانک الکتروفورز پایا پژوهش – ایران
منبع جریان الکتریکی مستقیم (D.C.) پایا پژوهش –ایران
دستگاه Gel Doc – BIO-RAD- آلمان
3-3- مواد و روش کار
3-3-1- نوع تحقیق
این مطالعه توصیفی و تحلیلی بوده و به روش مقطعی انجام گرفته است.

3-3-2- حجم نمونه
تعداد افراد لازم برای انجام این بررسی با استفاده از فرمول حجم نمونه تعیین گردید.
n=〖(z_(1-α/2))〗^2×p(p-1)/d^2

3-3-3- نمونه برداری:
نمونه¬ها در بخش آندوسکوپی بیمارستان امام رضا به صورت بیوپسی از قسمت آنتروم معده با آندوسکوپی و توسط فوق تخصص گوارش تهیه گردید. وسایل و محیط¬های لازم به بخش آندوسکوپی انتقال داده شد و قبل از آندوسکوپی از بیماران اطلاعات لازم تهیه و در فرم¬های مخصوص ثبت گردید. در طول این مطالعه از120 بیمار مبتلا به بیماری¬های گاسترودئودنال نمونه بیوپسی گرفته شد. از هر بیمار دو نمونه دقیقاً از آنتروم و کورپوس معده جهت تست اوره آز مایع وکشت گرفته شد. یکی از نمونه¬ها را از نظر وجود آنزیم اوره¬آز بررسی و دیگری در آزمایشگاه بر محیط¬های اختصاصی کشت داده شد.
نمونه¬ها با استفاده از محیط انتقال دهنده به بخش میکروب شناسی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی کرمانشاه انتقال داده شد. معیارهای ورود بیماران به مطالعه، دارا بودن شرایط زیر است:
کانسر(CA)- بیماران با آدنوکارسینوم معده که قبلاً تحت درمان (کموتراپی) قرار نگرفته اند و کانسر این افراد از طریق پاتولوژی ثابت شده است.
دئودنال اولسر(DU)- بیماران با اولسرهای پپتیک
بیمارانی که قبلاَ یا در حال حاضر مبتلا به PUD(Peptic Ulcer Disease) اند
بیماران مبتلا به اولسرهای گاستریک
بیمارانی که در دو هفته اخیر آنتی¬بیوتیک، ترکیبات بیسموت، مهارکننده¬های پمپ پروتونی یا NSAID دریافت کرده بودند از مطالعه حذف شدند.
بعد از انجام فرایند نمونه¬گیری مراحل بعدی آزمایش¬های میکروب شناسی شامل کشت نمونه¬های بیوپسی در محیط کلمبیا آگار غنی شده با زرده تخم مرغ و آنتی¬بیوتیک، انکوبه کردن در شرایط میکروآئروفیلیک،کشت مجدد جهت خالص سازی هلیکوباکتر پیلوری و آزمایشات مولکولی شامل استخراج DNA و PCR انجام شد.

مطلب مرتبط :   عقد، عهد، التزام، وعده، تعهد

3-4 روش¬های باکتریولوژیک
3-4-1- روش تهیه محیط انتقالی BHI:
از آنجا که بین زمان گرفتن بیوپسی در بخش آندوسکوپی بیمارستان تا کشت نمونه¬ها در آزمایشگاه وقفه حاصل می¬شد، در این مدت نمونه¬ها باید در شرایط مناسب نگهداری می-شدند. برای هلیکوباکتر پیلوری محیط¬های انتقالی مختلفی وجود دارد. در این مطالعه از محیط انتقالی بروسلا براث یا BHI (Brain Heart Infusion) با 25% گلیسرول استفاده شد. به این صورت که ابتدا 7/3 گرم از محیطBrain Hearust Infusion را وزن کرده، در 100 میلی لیتر آب مقطر حل گردید سپس به مدت 15 دقیقه در دمای 121 درجه سانتی گرادو فشار 15 پوند اتوکلاو شد. 1000 میکرولیتر گلیسرول به محیط اتوکلاو شده، اضافه کرده و تحت شرایط کاملا استریل داخل میکروتیوپ تقسیم گردید و در دمای4 درجه سانتیگراد نگهداری شد. مدت زمان نگهداری نمونه¬ها در محیط انتقالی نباید بیشتر از 12 ساعت باشد[95]. در این مطالعه نمونه¬ها در کمتر از 2 ساعت به آزمایشگاه منتقل می شد.

3-4-2-روش تهیه محیط کشت کلمبیا آگار غنی شده با زرده¬ی تخم مرغ:
برای تهیه 500 میلی لیتر محیط کلمبیا آگار مقدار 21 گرم از پودر پایه محیط کشت در 450 میلی لیتر آب مقطر حل و پس از حرارت دادن روی شعله، برای استریل شدن، 15 دقیقه در دمای 121 و فشار 15 پوند اتو کلاو گردید. پس از اتوکلاو، زمانی که دمای محیط کشت به حدود 50 درجه رسید در کنار شعله آن 50 میلی لیتر زرده تخم مرغ صاف شده اضافه شد، همچنین برای جلوگیری از آلودگی¬های محیط کشت، به علت آلوده بودن بیوپسی با میکروفلور حلق و دهان به آن آنتی¬بیوتیک¬های مناسب شامل 500 میکرو لیتر ونکومایسین، 130 میکرولیترآمفوتریسینB، 500 میکرو لیترتری متوپریم اضافه شد. محیط کشت پس از تهیه در پلیت¬های استریل تقسیم و جهت اطمینان از عدم آلودگی، 24 ساعت در 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد و تا موقع مصرف در داخل کیسه¬های پلاستیکی در یخچال نگهداری شدند. برای دست یابی به نتیجه مناسب، بهتر است از محیط کشت¬هایی که بیش ازدو هفته تاریخ ساخت آنها می¬گذرد، استفاده نشود.

3-4-3- طرز تهیه¬ی آنتی¬بیوتیک برای محیط کشت:
-ونکومایسین:
mg50 پودر ونکومایسین در mL 5 آب استریل شد سپس فیلتر شده و در شرایط استریل تقسیم گردید.
-تری¬متو¬پریم:
ml 5/2کلروفرم بعلاوه ml5/2 اتانول مطلق (Merc)، با mg 50 پودر تری¬متو¬پریم مخلوط شد سپس برای استریل شدن از فیلتر عبور داده و در میکروتیوپ استریل تقسم شد.
-آمفوتریسینB:
این آنتی¬بیوتیک به صورت آماده است قبل از استفاده 5 میلی لیتر آب استریل به ویال اضافه شد.
3-4-4-روش تهیه محیط اوره:

Urea : 1gr
Yeast : 0/005gr
Na2Hpo4 : 0/00475
KH2po4 : 0/00455
Phenol Red : 0/0005
Distill Water : 50ml

محیط اوره جهت آزمون اوره آز سریع تهیه شد. بعد از نمونه¬گیری بلا فاصله یکی از نمونه¬ها در میکروتیوپ حاوی محیط اوره قرار داده شد. در صورتی که نمونه مورد نظر بعد از قرار گیری در محیط اوره، بعد از 2 تا 4 ساعت باعث تغییر رنگ محیط اوره (از رنگ زرد به ارغوانی) می¬شد به عنوان نمونه اوره آز مثبت تلقی می¬گردید.
3-4-5-کشت نمونه¬ها و شرایط انکوباسیون:
نمونه¬های موجود در محیط انتقالی به بخش میکروب شناسی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی کرمانشاه انتقال داده شد. نمونه¬ها توسط لوپ استریل از داخل محیط انتقالی خارج و هر نمونه بر روی حداقل 2 پلیت کشت داده شد. پلیت¬ها در داخل جار بی¬هوازی قرار داده شد و پس از قرار دادن گاز پک میکروآئروفیل، در 37 درجه سانتیگراد به مدت 3 تا 5 روز انکوبه شدند. پس از گذشت این مدت نمونه¬ها را از داخل انکوباتور خارج ودر صورت مشاهده رشد باکتری، تست¬های تاییدی بر روی کلنی¬ها انجام گردید.

3-4-6- تشخیص کلنی¬های H. pylori
برای تشخیص H. pylori تست¬هایی انجام شد که شامل موارد زیر می¬شود:
الف) صفات ظاهری کلنی¬ها: کلنی هایH. pylori بسیار تیپیک و مشخص هستند وشکل کلنی¬ها می¬تواند راهنمای تشخیص باشد. ظاهرکلنی¬هاگرد، برآمده، صاف، شفاف و قوام آبکی دارند و دارای 5/0 تا 1 میلی متر قطر هستند.
ب) رنگ آمیزی گرم: از کلنی¬های مشکوک برداشته و بر روی لام گسترش تهیه گردید و پس از فیکساسیون و رنگ آمیزی گرم با میکروسکوپ نوری به جستجوی باکتری گرم منفی و خمیده پرداخته شد.
ج) تست¬های بیوشیمیایی
شکل(3-1):میکروتیوب سمت راست نشان دهنده تست مثبت اور میکروتیوب سمت چپ نشان دهنده تست منفی اوره
1-تست اوره آز سریع: دراین تست پس از انداختن نمونه بیوپسی در داخل میکروتیوپ حاوی محیط اوره ساخته شده، پس از گذشت 2تا 4 ساعت اگر رنگ ارغوانی مشاهده می-شد تست اوره آز مثبت در نظر گرفته می¬شد(تست اوره آز هم برای نمونه بیوپسی و هم بر روی کلنی¬های بالا آمده بر روی محیط کشت گذاشته شد).
2- تست کاتالاز: برای شناسایی آنزیم کاتالاز باکتری انجام گرفت. روش انجام تست کاتالاز به این صورت بود که یک قطره آب اکسیژنه 3% را روی اسلاید گذاشته، و از کلنی های مشکوک برداشت نموده و با آن مخلوط شدند که در صورت مشاهده حباب، پاسخ، مثبت در نظر گرفته شد.
3- تست اکسیداز: برای شناسایی سیستم سیتوکروم اکسیداز انجام شد. یک کلنی روی دیسک مرطوب شده قرار داده شد بعد از گذشت 60 ثانیه، ایجاد رنگ بنفش (تیره) نتیجه مثبت شدن تست بود.

3-4-7 پاساژ در محیط جامد:
بعد از ایزولاسیون اولیه باکتری برای پاساژ، باید کلنی¬های بیشتری برداشته شود و در سطح محیط پخش گردد و پلیت¬های کشت داده شده در جار بی¬هوازی قرار داده می¬شد و پس از قرار دادن گاز پک میکروآئروفیل در 37 درجه سانتیگراد به مدت 3 روز قرار گرفت که بعد از این مدت رشد بخوبی نمایان است.

3-5 استخراج DNA
باکتری تازه رشد یافته بر روی محیط کلمبیا آگار جهت استخراج DNAاستفاده شد. استخراج DNA با استفاده از کیت استخراج DNA، Cina pure و بر طبق دستورالعمل کیت انجام گرفت.
مراحل استخراج:
1000 میکرولیتر نرمال سالین را در میکروتیوپ¬های 5/1 استریل ریخته وباکتری کشت داده شده بر روی کلمبیا آگارحاوی زرده تخم مرغ با سواب جمع¬آوری و به نرمال سالین اضافه شد ه به مدت 3 دقیقه در دور 12000 سانتریفیوژ گردید، مایع سطحی را دور ریخته نرمال سالین اضافه شد وبعد از ورتکس، در همان دور ومدت سانتریفیوژ صورت گرفت. برای دومین بار نیز این کار تکرار شد. به میکروتیوپ µl400، Lysise Buffer اضافه شده بعد از ورتکس به مدت 30 دقیقه در دمای 55 درجه سانتیگراد درون بن ماری قرار داده شد. lµ300 از محلول Precipitation به میکروتیوپ اضافه و ورتکس به مدت 5 ثانیه انجام گرفت. محتوی میکروتیوپ را به میکروتیوپ جدید منتقل کرده و به مدت 1 دقیقه در دورrpm 13000 سانتریفیوژ شد. مایع زیرین میکروتیوپ دور ریخته شد وl µ400، WashbufferI به میکروتیوپ اضافه گردید و به مدت 1 دقیقه در دور rpm13000 سانتریفیوژ شد. مایع زیرین میکروتیوپ دور ریخته شد وlµ 400، Wash bufferII افزوده و به مدت 1 دقیقه در دور rpm13000 سانتریفیوژ شد. یک بار دیگر به میکروتیوپ lµ400، Wash bufferIIاضافه کرده وسانتریفیوژ صورت گرفت و مایع زیرین میکروتیوپ دور ریخته شد. به مدت 1 دقیقه در دور rpm13000 سانتریفیوژ به صورت خشک انجام شد. میکروتیوپ زیرین را عوض کرده میکروتیوپ جدید در زیر قسمت فیلتر دار قرار داده شد، سپس Elution buffer را در بن ماری 65 درجه سانتیگراد به مدت 3 تا 5 دقیقه قرار داده و µl 50 از آن را به میکروتیوپ اضافه کرده و به مدت 1 دقیقه در rpm13000 سانتریفیوژ شد. شماره نمونه ها و تاریخ استخراج را روی میکروتیوبها نوشته و در یخچال 4 درجه نگهداری شد.

3-6- واکنش زنجیره ای پلی¬مراز(PCR) :
این تکنیک در سال 1983توسط کری مولیس معرفی شد. اساس این تکنیک براین پایه است که آنزیم DNA پلی¬مراز از طریق طویل سازی رشته مکمل، یک قطعه اختصاصی در داخل ژن مورد نظر را کپی برداری می¬کند.
مواد مورد نیاز برای واکنش PCR:
dNTP-
H2O-
10x buffer-
MgCl2-
Primer-
Taq polymerase-
DNA-
روش کار: قبل از آغاز کار فضای زیر هود به مدت نیم ساعت با تابش لامپ UV استریل شده، سپس تمام سطح زیر هود با پنبه الکل 70% استریل گردید. در ادامه تمام سطح داخلی هود و سمپلرها با وایتکس 20% تمیز شدند. الکل 70% ارگانیسم¬های زنده را از بین می¬برد و وایتکس 20% برای از بین بردن DNA به جای مانده از مرگ ارگانیسم¬های کشته شده است. مواد مورد نیاز برای انجام PCR، جهت ذوب شدن از فریزر خارج شد(به جز آنزیم) همچنین نمونه¬های DNA مورد نظر را به همراه کنترل¬های مثبت و منفی خارج کرده و همه مواد روی یخ خرد شده قرار داده شد. برای هر نمونه یک میکروتیوپ 2/0 میلی¬لیتری انتخاب شد. جهت انجام PCR اولین مرحله تهیه MASTER MIXاست. کلیه مواد مورد نیاز بر اساس تعداد نمونه محاسبه شده و به صورت کلی ساخته می¬شود. پرایمرهای مورد استفاده در مورد ژن CagA در جدول زیر آمده است.که با استفاده از نرم افزارهای اولیگوکالک واولیگوآنالایزر وNCBI بلاست، طبق ژنوم سویه J99 طراحی شد به گونه¬ای که موتیف¬های EPIYA، ژن CagA را در برداشته باشد.

Nearest neighbor F =46/76 C
G=0/74 kcal.mol-1 Δ
GC=47%
TM=6/7 C
Nearest neighbor R= 45/37C
G=0/66 kcal.mol-1 Δ
GC=53%
TM=33/5 C
Ta=Tm-(2/3)
جدول(3-1): پرایمرهای مورد استفاده وسکانس آن¬ها.
Gene Primers Size of PCR products
CagA F GAT TTC AGT AGG GTA GAG C 770 bp
CagA R GTG TGG CTG TTA GTA GC

جدول (3-2): فرمولاسیون MASTER MIX برای ژن cagA.
Master Mix for
1 Reactin

1/5µl 10XBuffer
0/5µl MgCl2
0/3µl Dntp
9/45 µl H2O
2 µl Primer forward
2 µl Primer reverse
0/25 µl Taq polymerase
1 µl DNA
15 µl Total

از آنجایی که حجم اجزای ذکر شده بسیار کم است و تهیه هرنمونه PCR به صورت مجزا زمان بر و دشوار است، مطابق با جدول بالا یک مستر میکس کلی حاوی تمام اجزا به جز DNA استخراج شده مربوط به هرنمونه، برای چندین نمونه تهیه شد. MASTER MIX تهیه شده همیشه برای یک نمونه بیشتر از محاسبات انجام شده تهیه شد زیرا به علت خطا در برداشت مایعات توسط سمپلر ممکن است میزان MASTER MIX برای نمونه آخر کمتر از میزان مورد نظر شود. در هر سری PCR یک نمونه کنترل مثبت و یک نمونه کنترل منفی تهیه شد. نمونه کنترل مثبت دارای DNA استخراج شده از کلنی باکتری بررسی شده است و از آن به عنوان معیاری برای تشخیص ایزوله¬هایی که ژن مورد نظر را دارند استفاده گردید.
نمونه کنترل منفی DNA ندارد و هم حجم DNA به نمونه کنترل منفی آب مقطر استریل اضافه شد. پس از انجام PCR کنترل منفی باید باندی نداشته باشد.
حجم نهایی مخلوط PCR برای هر نمونه 15 میکرولیتر است. سیکل مطلوب جهت انجام PCR ژن CagA در جدول زیر آمده است. الکتروفورز محصول تکثیر یافته PCR با استفاده از ژل آگارز انجام شد و پس از رنگ آمیزی مورد بررسی قرار گرفت.
جدول(3-3): برنامه PCRژن CagA.
Program Step Definition Temperature Time Cycle
Prog.1 1 Heat start 94 5MIN 1
Prog.2 1
2
3 Denaturation
Annealing
Extension 94
59
72 30S
30S
30S 30
30
30
Prog.3 1 Final
Extension 72 5MIN 1

3-7- روش¬های تهیه محلول¬ها ی آزمایش¬های مولکولی
3-7-1 -طرز تهیه بافر EDTA-Borate- Tris(TBE)
54 گرم پودر Tris-HCL
7/5 گرم اسید بوریک
EDTA 20 ml
1لیتر آب مقطر
PH:8

3-8-الکتروفورز ژل و Load کردن نمونه¬ها:
متداول¬ترین و ساده ترین روش بررسی محصولات PCR شامل الکتروفورز روی ژل استاندارد آگاروز1% است.

3-8-1-وسایل و مواد لازم:
– بافر الکتروفورز
– اتیدیوم بروماید
– ژل آگاروز
-لودینگ بافر
– مارکر مولکولی DNA با وزن 100 -1000
– تانک الکتروفورز
– سمپلر و سر سمپلر
– دستگاه gel documentation

3-8-2 روش انجام الکتروفورز:
با استفاده از ترازوی دیجیتالی 2/0 گرم از پودر آگاروز را وزن کرده و در داخل ارلن به 20 سی سیTBE 1 X اضافه شد. سپس محلول، حرارت داده شد تا ذرات آگاروز کاملا حل شوند. پس از چند دقیقه که به دمای متعادل رسید داخل کست مخصوص ژل که حاوی شانه 15 خانه ای بود ریخته شد. پس از بستن کامل ژل در داخل کست، به آرامی شانه خارج شد. سپس کست داخل تانک الکتروفورز قرار داده شد. محتوای تانک از بافر x 1پر شد تا بافر تمام سطح ژل را بگیرد. سپس روی میز استریل یک قطعه پارافیلم استریل قرار داده و به تعداد نمونه¬ها ی PCR قطرات با حجم µl 3 از لودینگ بافر قرار داده شد.10 میکرولیتر از هر نمونه با 3 میکرولیتر لودینگ بافر مخلوط شد بدین ترتیب که با استفاده از سر سمپلرهای کریستالی استریل و مجزا برای هر نمونه، حجم 10 میکرولیتر از نمونه PCR برداشته شد. نوک سر سمپلر را در قطره لودینگ بافر فرو برده و نمونه PCR شده، چند بار با لودینگ بافر در داخل سر سمپلر مخلوط شد. سپس نمونه PCR شده و لودینگ بافر در چاهک¬های ژل الکتروفورز تزریق گردید. در چاهک اول نیز 6 میکرولیتر مارکر مولکولی 100-1000 قرار داده شد. در دو چاهک نیز از کنترل¬های مثبت و منفی استفاده شد. تانک الکتروفورز به دستگاه power supply متصل شد. قطب منفی دستگاه باید به سمت چاهک¬ها باشد زیرا DNA دارای بار منفی است و در ژل از قطب منفی به سمت قطب مثبت حرکت می¬کند دستگاه روی 70 ولت برای مدت 60 دقیقه تنظیم شد. پس از اتمام الکتروفورز ژل با احتیاط از تانک خارج شد و به مدت 10 دقیقه در محلول اتیدیوم بروماید قرار گرفت. سپس ژل را خارج کرده و به مدت 5 دقیقه در ظرف حاوی آب مقطر غوطه ور گردید تا اتیدیوم بروماید سطح ژل را کاملا شستشو دهد و سپس ژل در داخل دستگاه geldocumentation با نرم افزار Quantity-one-installer مورد بررسی قرار گرفت.

3-9 روش تجزیه و تحلیل اطلاعات:
داده¬ها پس از ورود به نرم افزار آماری SPSS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. برای آنالیز فراوانی هر یک از ژن¬ها و ژنوتیپ¬ها از آزمون¬های فراوانی استفاده شد. برای تعیین ویژگی پرایمرها از نرم افزارهایی مانند اولیگوکالک، اولیگوآنالایزر و برای بررسی شباهت¬های سکانس ها از بلاست استفاده شد. برای تعیین ارتباط آماری بین ژنوتایپ و بیماری¬ها از آزمون کای دو استفاده شد.

فصل چهارم:

نتایج،بحث و پیشنهادات

4-1- نتایج مربوط به کشت هلیکوباکتر پیلوری
از120 بیمار مبتلا به بیماری¬های گاسترودئودنال مراجعه کننده به بخش آندوسکوپی بیمارستان امام رضا استان کرمانشاه دو نمونه بیوپسی بر اساس نمای بالینی معده از نواحی کورپوس و آنتروم توسط پزشک فوق تخصص بیماری¬های گوارشی گرفته شد. از این تعداد 59 نمونه مربوط به زنان و61 نمونه مربوط به مردان بود. و تعداد 52 (3/43% ) ایزوله هلیکوباکتر پیلوری جداسازی شد که 17 نمونه(16/14٪) مربوط به زنان و 35 نمونه (16/29 ٪) مربوط به مردان بود. سن بیماران مورد مطالعه بین 17-87 سال بود. در این بررسی میانگین سنی برای افراد با کشت مثبت 78/46 سال، در زنان 46/45٪ و در مردان 1/48٪ بود.

جدول (4-1): توزیع فراوانی مطلق ونسبی بیماران به تفکیک جنس و نتیجه کشت.
جمع کشت منفی کشت مثبت جنسیت
(1/49% ) 59 (35% ) 42 (1/14%) 17 زن
(8/50%) 61 (66/21%) 26 (1/29%) 35 مرد
(100%) 120 (6/56%) 68 (3/43%) 52 مجموع

4-2- فراوانی مطلق ونسبی هلیکوباکترپیلوری براساس نتایج کشت اوره-آز
از 120 نمونه بیوپسی گرفته شده از افراد مبتلا به بیماری¬های گوارشی، 65 (1/54%) نمونه در آزمون اوره¬آز سریع، مثبت و 55 (8/45%) مورد منفی شد. در کشت نمونه¬های بیوپسی52 (3/43%) نمونه مثبت و 68 (6/56%) نمونه منفی شد (جدول 4-2).

جدول 4-2 توزیع فراوانی مطلق ونسبی هلیکوباکتر پیلوری در افراد مبتلا به بیماری¬های گاسترودئودنال بر حسب تست اوره آز و کشت.

مجموع کشت منفی کشت مثبت کشت
اوره آز

(1/54%)65 (3/13%)16 (8/40%)49 اوره آزمثبت
(8/45%)55 (3/43%)52 (5/2%) 3 اوره آز منفی
(100%)120 (6/56%)68 (3/43%) 52 مجموع

از(1/54%)65 نمونه بیوپسی که با آزمون اوره¬آز مثبت شده بودند (6/44%) 29 بیمار زن و(3/55%) 36 بیمار مرد بودند. از(3/43%) 52 نمونه بیوپسی که توسط کشت مثبت شده بودند، (6/32%) 17 بیمار زن و(3/67%) 35 بیمار مرد بودند.
از 55 بیوپسی که در آزمون اوره¬آز منفی شدند، (5/45%)30 بیمار زن و(4/45%)25 بیمار مرد بودند. همچنین از(6/56%)68 نمونه بیوپسی منفی شده توسط کشت، (3/13%)16 بیمار زن و(3/43%)52 بیمار مرد بودند.

جدول 4-3 توزیع فراوانی مطلق ونسبی نتایج آزمون اوره¬آز سریع در بیماران مورد مطالعه بر اساس جنس.
مجموع منفی مثبت اوره آز
جنسیت
(1/49 %) 59 (5/54%)30 (6/44%) 29 زن
(8/50%)61 (4/45%)25 (3/55%) 36 مرد
(100%)120 (100%)55 (100%) 65 مجموع

جدول 4-4 –توزیع فراوانی مطلق و نسبی نتایج کشت در بیماران مورد مطالعه بر اساس جنس
مجموع منفی مثبت کشت
جنسیت
(1/49%)59 (7/61%)42 (6/32%)17 زن
(8/50%)61 (2/38%)26 (3/67%)35 مرد
(100%)120 (100%)68 (100%)52 مجموع

در این پژوهش برای ارزیابی گروه¬های سنی، بیماران به 4 گروه سنی از 15سال تا بالای 60 سال تقسیم¬بندی شدند. با توجه به جدول(4-5) گروه 45 تا 60 سال بیشترین تعداد بیماران مبتلا به گاستریت و گروه 15 تا 30 سال کمترین تعداد را به خود اختصاص داده است. از مجموع 50 (100%) نمونه بیوپسی که کشت آن¬ها مثبت شد،27 (54%) نفر مبتلا به گاستریت، 12(24%) نفر مبتلا به زخم معده و زخم اثنی عشر، 5 (10%) نفر مبتلا به سرطان معده و 6 (12%) نفر به NUD مبتلا بودند.

جدول(4-5): توزیع فراوانی مطلق و نسبی گروه¬های سنی بیماران بر اساس وضعیت بالینی.

مجموع بالای 60 سال 45-60 30-45 15-30 سن
وضعیت بالینی
27(54%) 8(16%) 9(18%) 7(14 %) 3(6%) گاستریت
12(24%) 4 (8%) 2(4%) 2(4%) 4(8%) زخم
5(10%) 2(4%) 3(6%) 0 0 سرطان معده
6(12%) 0 1(2%) 2(4%) 3(6%) NUD
50(100%) 14(28%) 15(30%) 11(22%) 10(20%) مجموع

جدول 4-6- توزیع فراوانی مطلق و نسبی وضعیت بالینی بیماران با کشت مثبت، براساس جنس.
وضعیت بالینی
جنس گاستریت زخم سرطان NUD مجموع
زن 11(22%) 6 (12%) 0 1(2%) 18(36%)
مرد 16(32%) 6(12%) 5 (10%) 5(10%) 32(64%)
مجموع 27(54%) 12(24%) 5(10%) 6 (12%) 50(100%)

4-3- نتایج PCR انجام شده
بر روی 50 نمونه DNA استخراج شده، از کشت بیوپسی¬های بیماران گوارشی، PCR برای شناسایی ژن CagA صورت گرفت. ژن CagA در40 (80%) مورد از نمونه¬ها مثبت و در 10 (20%) نمونه منفی شد که از این تعداد (5/32%) 13 مورد زن (5/67%) 27 مورد مرد بودند.

مجموع منفی مثبت PCR

جنسیت
(36%)18 (10%)5 (5/32%) 13 زن
(64%)32 (10%)5 (5/67%) 27 مرد
(100%)50 (20%)10 (80%) 40 مجموع
جدول4-7 توزیع فراوانی مطلق ونسبی نتایج PCR بر اساس جنسیت.

شکل (4-1): چاهک شماره 1 از سمت چپ نمونه کنترل مثبت ژن cagA، چاهک شماره 2 از سمت چپ نمونه کنترل منفی ژن cagA، چاهک شماره 3 از سمت چپ نمونه مثبت PCR (bp 770(، چاهک 4 مربوط به سویه فاقد ژن cagA، چاهک های 5 و6 و7 نمونه های مثبت دارای ژن cagA.

جدول 4-7 توزیع فراوانی مطلق و نسبی حضور ژن cagA براساس وضعیت بالینی بیماران در این بررسی.
کل NUD سرطان زخم گاستریت
وضعیت بالینی ژن cagA
40 (80%) 5 (3/83%) 4 (80%) 11 (6/91%) 20 (74 %) موارد مثبت
10 (20%) 1 (6/16%) 1(20%) 1 (3/8%) 7 (9/25%) موارد منفی
50(100%) 6(12%) 5(10%) 12(24%) 27(54%) مجموع

(درجه معناداری)P: .252
آنالیز آماری نشان داد که بین وضعیت بالینی بیماران و ژن CagA ارتباط معنا داری وجود ندارد.
از مجموع 40 سویه هلیکوباکتر پیلوری CagAمثبت جدا شده، از بیماران مبتلا به بیماری¬های گاسترودئودنال، 20 نفر مبتلا به گاستریت،11 بیمار مبتلا به زخم¬های معده و اثنی¬عشر، 4 نفر مبتلا به سرطان معده و6 نفر دیس¬پپسی داشتند. بعد از انجام فرایند PCR، محصولات PCR تعیین توالی شدند. نتایج حاصل از تعیین توالی با استفاده از نرم افزار clustal W2 با هم مقایسه شدند و توالی¬های DNA به آمینو اسید تبدیل شده، آمینواسید ها با clustal W2 هم مقایسه شدند و در نهایت توسط NCBI بلاست با سایر توالی¬های موجود مقایسه شدند.
از بین 40 مورد هلیکوباکتر پیلوری CagA مثبت ایزوله از بیماران مبتلا به ناراحتی¬های گوارشی، همه¬ی ژن¬های CagA از نوع غربی بودند. و موتیف¬های EPIYA، از نوع EPIYA-C 35 مورد(5/87%) بودند. 2(5%)مورد از نوع موتیف EPIYA-AB و3 (5/7%) مورد از نوع موتیف¬هایEPIYA-CC بود.
فراوانی موتیف EPIYA-C در بین بیماران مبتلا به و زخم معده و گاستریت بیشتر بود. وهیچ¬گونه موتیف نوع EPIYA-D آسیای شرقی در ایزوله¬ها مشاهده نشد. فراوانی موتیف EPIYA-CC در دو مورد از بیماران مبتلا به سرطان یافت شد.

دسته بندی : علمی