آنجا که بین زمان گرفتن بیوپسی در بخش آندوسکوپی بیمارستان تا کشت نمونه¬ها در آزمایشگاه وقفه حاصل می¬شد، در این مدت نمونه¬ها باید در شرایط مناسب نگهداری می-شدند. برای هلیکوباکتر پیلوری محیط¬های انتقالی مختلفی وجود دارد. در این مطالعه از محیط انتقالی بروسلا براث یا BHI (Brain Heart Infusion) با 25% گلیسرول استفاده شد. به این صورت که ابتدا 7/3 گرم از محیطBrain Hearust Infusion را وزن کرده، در 100 میلی لیتر آب مقطر حل گردید سپس به مدت 15 دقیقه در دمای 121 درجه سانتی گرادو فشار 15 پوند اتوکلاو شد. 1000 میکرولیتر گلیسرول به محیط اتوکلاو شده، اضافه کرده و تحت شرایط کاملا استریل داخل میکروتیوپ تقسیم گردید و در دمای4 درجه سانتیگراد نگهداری شد. مدت زمان نگهداری نمونه¬ها در محیط انتقالی نباید بیشتر از 12 ساعت باشد[95]. در این مطالعه نمونه¬ها در کمتر از 2 ساعت به آزمایشگاه منتقل می شد.

3-4-2-روش تهیه محیط کشت کلمبیا آگار غنی شده با زرده¬ی تخم مرغ:
برای تهیه 500 میلی لیتر محیط کلمبیا آگار مقدار 21 گرم از پودر پایه محیط کشت در 450 میلی لیتر آب مقطر حل و پس از حرارت دادن روی شعله، برای استریل شدن، 15 دقیقه در دمای 121 و فشار 15 پوند اتو کلاو گردید. پس از اتوکلاو، زمانی که دمای محیط کشت به حدود 50 درجه رسید در کنار شعله آن 50 میلی لیتر زرده تخم مرغ صاف شده اضافه شد، همچنین برای جلوگیری از آلودگی¬های محیط کشت، به علت آلوده بودن بیوپسی با میکروفلور حلق و دهان به آن آنتی¬بیوتیک¬های مناسب شامل 500 میکرو لیتر ونکومایسین، 130 میکرولیترآمفوتریسینB، 500 میکرو لیترتری متوپریم اضافه شد. محیط کشت پس از تهیه در پلیت¬های استریل تقسیم و جهت اطمینان از عدم آلودگی، 24 ساعت در 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد و تا موقع مصرف در داخل کیسه¬های پلاستیکی در یخچال نگهداری شدند. برای دست یابی به نتیجه مناسب، بهتر است از محیط کشت¬هایی که بیش ازدو هفته تاریخ ساخت آنها می¬گذرد، استفاده نشود.

3-4-3- طرز تهیه¬ی آنتی¬بیوتیک برای محیط کشت:
-ونکومایسین:
mg50 پودر ونکومایسین در mL 5 آب استریل شد سپس فیلتر شده و در شرایط استریل تقسیم گردید.
-تری¬متو¬پریم:
ml 5/2کلروفرم بعلاوه ml5/2 اتانول مطلق (Merc)، با mg 50 پودر تری¬متو¬پریم مخلوط شد سپس برای استریل شدن از فیلتر عبور داده و در میکروتیوپ استریل تقسم شد.
-آمفوتریسینB:
این آنتی¬بیوتیک به صورت آماده است قبل از استفاده 5 میلی لیتر آب استریل به ویال اضافه شد.
3-4-4-روش تهیه محیط اوره:

Urea : 1gr
Yeast : 0/005gr
Na2Hpo4 : 0/00475
KH2po4 : 0/00455
Phenol Red : 0/0005
Distill Water : 50ml

محیط اوره جهت آزمون اوره آز سریع تهیه شد. بعد از نمونه¬گیری بلا فاصله یکی از نمونه¬ها در میکروتیوپ حاوی محیط اوره قرار داده شد. در صورتی که نمونه مورد نظر بعد از قرار گیری در محیط اوره، بعد از 2 تا 4 ساعت باعث تغییر رنگ محیط اوره (از رنگ زرد به ارغوانی) می¬شد به عنوان نمونه اوره آز مثبت تلقی می¬گردید.
3-4-5-کشت نمونه¬ها و شرایط انکوباسیون:
نمونه¬های موجود در محیط انتقالی به بخش میکروب شناسی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی کرمانشاه انتقال داده شد. نمونه¬ها توسط لوپ استریل از داخل محیط انتقالی خارج و هر نمونه بر روی حداقل 2 پلیت کشت داده شد. پلیت¬ها در داخل جار بی¬هوازی قرار داده شد و پس از قرار دادن گاز پک میکروآئروفیل، در 37 درجه سانتیگراد به مدت 3 تا 5 روز انکوبه شدند. پس از گذشت این مدت نمونه¬ها را از داخل انکوباتور خارج ودر صورت مشاهده رشد باکتری، تست¬های تاییدی بر روی کلنی¬ها انجام گردید.

مطلب مرتبط :   مصدق، -، ، شاه، مجلس

3-4-6- تشخیص کلنی¬های H. pylori
برای تشخیص H. pylori تست¬هایی انجام شد که شامل موارد زیر می¬شود:
الف) صفات ظاهری کلنی¬ها: کلنی هایH. pylori بسیار تیپیک و مشخص هستند وشکل کلنی¬ها می¬تواند راهنمای تشخیص باشد. ظاهرکلنی¬هاگرد، برآمده، صاف، شفاف و قوام آبکی دارند و دارای 5/0 تا 1 میلی متر قطر هستند.
ب) رنگ آمیزی گرم: از کلنی¬های مشکوک برداشته و بر روی لام گسترش تهیه گردید و پس از فیکساسیون و رنگ آمیزی گرم با میکروسکوپ نوری به جستجوی باکتری گرم منفی و خمیده پرداخته شد.
ج) تست¬های بیوشیمیایی
شکل(3-1):میکروتیوب سمت راست نشان دهنده تست مثبت اور میکروتیوب سمت چپ نشان دهنده تست منفی اوره
1-تست اوره آز سریع: دراین تست پس از انداختن نمونه بیوپسی در داخل میکروتیوپ حاوی محیط اوره ساخته شده، پس از گذشت 2تا 4 ساعت اگر رنگ ارغوانی مشاهده می-شد تست اوره آز مثبت در نظر گرفته می¬شد(تست اوره آز هم برای نمونه بیوپسی و هم بر روی کلنی¬های بالا آمده بر روی محیط کشت گذاشته شد).
2- تست کاتالاز: برای شناسایی آنزیم کاتالاز باکتری انجام گرفت. روش انجام تست کاتالاز به این صورت بود که یک قطره آب اکسیژنه 3% را روی اسلاید گذاشته، و از کلنی های مشکوک برداشت نموده و با آن مخلوط شدند که در صورت مشاهده حباب، پاسخ، مثبت در نظر گرفته شد.
3- تست اکسیداز: برای شناسایی سیستم سیتوکروم اکسیداز انجام شد. یک کلنی روی دیسک مرطوب شده قرار داده شد بعد از گذشت 60 ثانیه، ایجاد رنگ بنفش (تیره) نتیجه مثبت شدن تست بود.

3-4-7 پاساژ در محیط جامد:
بعد از ایزولاسیون اولیه باکتری برای پاساژ، باید کلنی¬های بیشتری برداشته شود و در سطح محیط پخش گردد و پلیت¬های کشت داده شده در جار بی¬هوازی قرار داده می¬شد و پس از قرار دادن گاز پک میکروآئروفیل در 37 درجه سانتیگراد به مدت 3 روز قرار گرفت که بعد از این مدت رشد بخوبی نمایان است.

3-5 استخراج DNA
باکتری تازه رشد یافته بر روی محیط کلمبیا آگار جهت استخراج DNAاستفاده شد. استخراج DNA با استفاده از کیت استخراج DNA، Cina pure و بر طبق دستورالعمل کیت انجام گرفت.
مراحل استخراج:
1000 میکرولیتر نرمال سالین را در میکروتیوپ¬های 5/1 استریل ریخته وباکتری کشت داده شده بر روی کلمبیا آگارحاوی زرده تخم مرغ با سواب جمع¬آوری و به نرمال سالین اضافه شد ه به مدت 3 دقیقه در دور 12000 سانتریفیوژ گردید، مایع سطحی را دور ریخته نرمال سالین اضافه شد وبعد از ورتکس، در همان دور ومدت سانتریفیوژ صورت گرفت. برای دومین بار نیز این کار تکرار شد. به میکروتیوپ µl400، Lysise Buffer اضافه شده بعد از ورتکس به مدت 30 دقیقه در دمای 55 درجه سانتیگراد درون بن ماری قرار داده شد. lµ300 از محلول Precipitation به میکروتیوپ اضافه و ورتکس به مدت 5 ثانیه انجام گرفت. محتوی میکروتیوپ را به میکروتیوپ جدید منتقل کرده و به مدت 1 دقیقه در دورrpm 13000 سانتریفیوژ شد. مایع زیرین میکروتیوپ دور ریخته شد وl µ400، WashbufferI به میکروتیوپ اضافه گردید و به مدت 1 دقیقه در دور rpm13000 سانتریفیوژ شد. مایع زیرین میکروتیوپ دور ریخته شد وlµ 400، Wash bufferII افزوده و به مدت 1 دقیقه در دور rpm13000 سانتریفیوژ شد. یک بار دیگر به میکروتیوپ lµ400، Wash bufferIIاضافه کرده وسانتریفیوژ صورت گرفت و مایع زیرین میکروتیوپ دور ریخته شد. به مدت 1 دقیقه در دور rpm13000 سانتریفیوژ به صورت خشک انجام شد. میکروتیوپ زیرین را عوض کرده میکروتیوپ جدید در زیر قسمت فیلتر دار قرار داده شد، سپس Elution buffer را در بن ماری 65 درجه سانتیگراد به مدت 3 تا 5 دقیقه قرار داده و µl 50 از آن را به میکروتیوپ اضافه کرده و به مدت 1 دقیقه در rpm13000 سانتریفیوژ شد. شماره نمونه ها و تاریخ استخراج را روی میکروتیوبها نوشته و در یخچال 4 درجه نگهداری شد.

مطلب مرتبط :   استقلال، انقلاب، اسلام، جمهوری، اسلامی،

3-6- واکنش زنجیره ای پلی¬مراز(PCR) :
این تکنیک در سال 1983توسط کری مولیس معرفی شد. اساس این تکنیک براین پایه است که آنزیم DNA پلی¬مراز از طریق طویل سازی رشته مکمل، یک قطعه اختصاصی در داخل ژن مورد نظر را کپی برداری می¬کند.
مواد مورد نیاز برای واکنش PCR:
dNTP-
H2O-
10x buffer-
MgCl2-
Primer-
Taq polymerase-
DNA-
روش کار: قبل از آغاز کار فضای زیر هود به مدت نیم ساعت با تابش لامپ UV استریل شده، سپس تمام سطح زیر هود با پنبه الکل 70% استریل گردید. در ادامه تمام سطح داخلی هود و سمپلرها با وایتکس 20% تمیز شدند. الکل 70% ارگانیسم¬های زنده را از بین می¬برد و وایتکس 20% برای از بین بردن DNA به جای مانده از مرگ ارگانیسم¬های کشته شده است. مواد مورد نیاز برای انجام PCR، جهت ذوب شدن از فریزر خارج شد(به جز آنزیم) همچنین نمونه¬های DNA مورد نظر را به همراه کنترل¬های مثبت و منفی خارج کرده و همه مواد روی یخ خرد شده قرار داده شد. برای هر نمونه یک میکروتیوپ 2/0 میلی¬لیتری انتخاب شد. جهت انجام PCR اولین مرحله تهیه MASTER MIXاست. کلیه مواد مورد نیاز بر اساس تعداد نمونه محاسبه شده و به صورت کلی ساخته می¬شود. پرایمرهای مورد استفاده در مورد ژن CagA در جدول زیر آمده است.که با استفاده از نرم افزارهای اولیگوکالک واولیگوآنالایزر وNCBI بلاست، طبق ژنوم سویه J99 طراحی شد به گونه¬ای که موتیف¬های EPIYA، ژن CagA را در برداشته باشد.

Nearest neighbor F =46/76 C
G=0/74 kcal.mol-1 Δ
GC=47%
TM=6/7 C
Nearest neighbor R= 45/37C
G=0/66 kcal.mol-1 Δ
GC=53%
TM=33/5 C
Ta=Tm-(2/3)
جدول(3-1): پرایمرهای مورد استفاده وسکانس آن¬ها.
Gene Primers Size of PCR products
CagA F GAT TTC AGT AGG GTA GAG C 770 bp
CagA R GTG TGG CTG TTA GTA GC

جدول (3-2): فرمولاسیون MASTER MIX برای ژن cagA.
Master Mix for
1 Reactin

1/5µl 10XBuffer
0/5µl MgCl2
0/3µl Dntp
9/45 µl H2O
2 µl Primer forward
2 µl Primer reverse
0/25 µl Taq polymerase
1 µl DNA
15 µl Total

از آنجایی که حجم اجزای ذکر شده بسیار کم است و تهیه هرنمونه PCR به صورت مجزا زمان بر و دشوار است، مطابق با جدول بالا یک مستر میکس کلی حاوی تمام اجزا به جز DNA استخراج شده مربوط به هرنمونه، برای چندین نمونه تهیه شد. MASTER MIX تهیه شده همیشه برای یک نمونه بیشتر از محاسبات انجام شده تهیه شد زیرا به علت خطا در برداشت مایعات توسط سمپلر ممکن است میزان MASTER MIX برای نمونه آخر کمتر از میزان مورد نظر شود. در هر سری PCR یک نمونه کنترل مثبت و یک نمونه کنترل منفی تهیه شد. نمونه کنترل مثبت دارای DNA استخراج شده از کلنی باکتری بررسی شده است و از آن به عنوان معیاری برای تشخیص ایزوله¬هایی که ژن مورد نظر را دارند

دسته بندی : علمی