می شد. دماهای پایین تر از 16 منجر به رشد ضعیف و دماهای بالاتر از 35 درجه نیز موجب مرگ و میر سریع در جلبک ها می شود.
3-1-3-3- pH
محدوده pH برای اغلب گونه های پرورشی بین 7 تا 9، با یک محدوده مساعد با دامنه بین 2/8 تا 7/8 می باشد. نابودی کامل پرورش به دلیل توقف بسیاری از فرایندهای سلولی می تواند منجر به عدم موفقیت در نگهداری pH در یک دامنه قابل قبول شود. این مسئله از طریق هوادهی محیط پرورشی برطرف می شود. در حجم های بزرگتر افزودن دی اکسید کربن به منظور اصلاح pH های بالا که ممکن است تا مقادیر محدود کننده بیش از 9 نیز در طول دوره پرورشی برسند، ضروری است.
3-1-3-4- هوادهی
به منظور جلوگیری از ته نشینی جلبک ها، و تضمین اینکه تمام جمعیت سلول ها بطور مساوی در معرض نور و مواد مغذی قرار می گیرند، و به منظور جلوگیری از لایه بندی حرارتی (در حجم های بزرگتر)، اضافه کردن منبع کربنی دی اکسید کربن و ارتقا تبادل گازها بین محیط پرورش و هوا، عمل هوادهی در مراحل مختلف کشت جلبک انجام می گیرد (بسته به حجم پرورشی، عمل هوادهی یا مخلوط کردن از طریق تکان دادن دستی بطور روزانه در لوله های آزمایشگاهی کشت اولیه جلبک یا توسط لوله های هوادهی متصل به پمپ مرکزی). لازم به ذکر است که شدت هوادهی بر حسب گونه پرورشی باید تنظیم شود. به منظور جلوگیری از ورود هرگونه آلودگی از طریق هوا، با استفاده از پنبه و زغال، فیلترهایی ساخته شده و هوا درست قبل از ورود به محیط کشت تصفیه می شود. درب ظروف پرورشی نیز باید توسط پنبه و فویل آلومینیوم بسته شود.
3-1-3-5- شوری
جلبک های دریایی عمدتا بهترین رشد خود را در شوری هایی که اندکی از شوری محیط های زیست طبیعی شان پایین تر است، انجام می دهند. که از طریق رقیق سازی آب دریا با افزودن مقداری آب شیر صورت می گیرد. دامنه شوری 120- 110 گرم در لیتر در این مـــطالعه بـــرای گـونه دونالیلا سالینا به عنوان شوری مساعد اعمال شد.
3-2- مراحل پرورش جلبک در آزمایشگاه
3-2-1- تهیه و نگهداری کشت ذخیره
جلبک مورد استفاده برای پرورش از نوع دونالیلا سالینا بود. نمونه خالص جلبک (کشت ذخیره یا استوک)، که بر روی محیط کشت جامد داخل لوله آزمایش قرار داشت از آزمایشگاه جلبک پژوهشکده مطالعات دریاچه ارومیهً دانشگاه ارومیه تهیه شد.
3-2-2- تهیه کشت ذخیره جدید
به یک ارلن مایر حاوی 1000 میلی لیتر آب دریای فیلتر شده (با شوری 120 گرم بر لیتر)، 15 گرم آگار و یک میلی لیتر محلول والنه افزوده شد و سپس اتوکلاو گردید (120 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه). بعد از اتوکلاو کردن اجازه داده شد تا محلول به آرامی سرد گردد. هرگاه دمای آن به حدود 40 درجه رسید 1/0 میلی لیتر محلول ویتامین به آن اضافه شده و به خوبی هم زده شد (Lavens & Sorgeloos, 1996). از محلول حاصل 20 میلی لیتر در لوله آزمایش 75 میلی لیتری استریل شده ریخته و لوله ها در روی یک محیط شیب دار قرار داده شدند تا محیط کشت داخل آنها بصورت شیب دار سفت گردد. به کمک آنس مقداری جلبک از کشت ذخیره اصلی برداشته و روی محیط آگار تازه تهیه شده منتقل گردید. لوله های کشت تحت شرایطی که ذکر شد قرار داده شدند.
3-2-3- انتقال جلبک از محیط جامد به محیط مایع
به تعدادی لوله آزمایش 75 میلی لیتری، 20 میلی لیتر آب فیلتر شده با شوری 120 گرم بر لیتر و 40 میکرو لیتر محلول والنه ریخته، درب لوله ها به کمک پنبه بسته و استریل شدند. بعد از سرد شدن لوله ها، یک الی دو کلنی از جلبکهای رشد یافته روی محیط جامد برداشته و به لوله ها اضافه گردید. لوله ها در شرایط پرورشی قرار داده شدند و روزانه چند بار بهم زده شدند. در این شرایط معمولا چند روز طول می کشد تا جلبکهای موجود در لوله ها بخوبی تکثیر شده و سبز شوند.
3-2-4- انتقال محتویات لوله ها به ارلن های 250 میلی لیتری
بعد از سبز شدن محیط کشت درون لوله ها، محتویات هر لوله را به یک ارلن مایر 250 میلی لیتری منتقل شدند. ارلن های مذکور استریل بوده و دارای آب دریای فیلتر شده، محلول والنه و ویتامین با مقادیر زیر می باشند:
200میلی لیتر آب دریا (شوری g/l120- 110) + lµ200 محلول والنه + lµ200 محلول ویتامین
3-2-5- انتقال محتویات ارلن های 250 میلی لیتری به ارلن های 5 لیتری
بعد از سبز شدن محیط کشت درون ارلن های 250 میلی لیتری، محتویات آنها را به ارلن های 5 لیتری منتقل گردید. در این مرحله ظروف پرورش جلبک باید هوادهی گردد. برای این کار، یک لوله پلاستیکی استریل را از میان پنبه موجود در دهانه ظرف پرورش وارد کرده و تا عمق ارلن فرو برده شد. لوله مذکور به کمک شیلنگ های هوادهی به پمپ مرکزی متصل گردید (درحالی که هوا قبل از ورود به محیط پرورش فیلتر می گردد) تا عمل هوادهی از ته ظروف انجام گیرد.
3-2-6- جمع آوری و برداشت جلبک
هرگاه غلظت جلبک در ارلن های 5 لیتری به حداکثر رشد خود رسید (مرحله کاهش نرخ رشد) عمل هوادهی را قطع کرده و جلبک موجود در آنرا به کمک سانتریفیوژ یا سرد کردن (در یخچال) جدا می شوند.

مطلب مرتبط :   مهمترین حالت­های ذهنی انسان چیست؟

شکل3-3- رویه تولید کشت جلبک به روش بچ کالچر (Lee & Tamaru, 1993)
3-2-7- تعیین کمیت توده زنده جلبک
جلبک غلیظ شده برای تغذیه آرتمیا ابتدا باید تا حد معین cell/ml106×18رقیق گردد. برای این کار ابتدا غلظت جلبک را به روش زیر تعیین می شود:
الف: آماده سازی نمونه
محلول غلیظ جلبک به خوبی تکان داده و بصورت کاملا همگن در می آید. سپس 1 میلی لیتر از آنرا به کمک یک سمپلر دقیق برداشته و به داخل یک بالن 50 میلی لیتری ریخته می شود. پس از تثبیت سلول ها با چند قطره محلول لوگول، به حجم 50 میلی لیتر رسانده و کاملا به هم زده می شود.
ب: شمارش جلبک در لام بورکر (Burker)
لام بورکر مورد استفاده برای شمارش جلبک های تک سلولی از دو بخش کاملا مشابه تشکیل شده است که هر بخش شامل یک مربع 12 × 12 خانه می باشد.
بوسیله یک پیپت پاستور یک قطره از جلبک رقیق شده را بین لام بورگر و لامل مخصوص قرار داده و دو بخش بالایی و پایینی لام را بطور جداگانه شمارش می کنیم.
حال با کمک رابطه زیر تراکم جلبک را بر حسب تعداد سلول در هر میلی لیتر محاسبه می کنیم:
رابطه3-1-فرمول شمارش جلبک: C=X×d×10000
غلظت جلبک در هر سی سی =C
تعداد جلبک شمارش شده در 25 خانه =X
واحد رقیق سازی استوک اصلی =d
3-3- آماده سازی غذای های اصلی (سبوس گندم و سبوس برنج)
3-3-1- آسیاب کردن و تهیه سوسپانسیون
سبوس گندم و سبوس برنج بکار رفته در این تحقیق که به عنوان منابع غذایی در تغذیه آرتمیا از روز اول بکار گرفته شد، از استان گلستان تهیه گردید. با توجه به سیستم تغذیه آرتمیا که تنها قادر به فیلتر کردن ذرات غذایی معلق و کوچکتر از 50 میکرون می باشد، لذا ابتدا می بایست این منابع غذایی بطور صحیح آماده سازی شوند تا بتوان در دسترس آرتمیا قرار داد.
ابتدا این مواد بطور جداگانه توسط یک دستگاه آسیاب برقی مدل دورانی ساخت شرکت ایران خودساز تا حد امکان ریز شدند. ذرات ریز شده به داخل یک ظرف استوانه ای انتقال داده شده و مقداری آب شیرین به آن اضافه شده و سپس توسط یک هم زن برقی آشپزخانه به مدت چند دقیقه به خوبی هم زده شد. سپس حجم آب را کمی افزایش داده و به مدت 1 ساعت به شدت از قسمت کف هوادهی شد. سپس با قطع هوادهی مخلوط حاصل ابتدا از فیلتر 200 میکرون و سپس بر حسب نیاز از فیلتر 30 و 50 میکرون عبور داده شد. مواد حاصل از عبور فیلتر 30 میکرونی برای آرتمیاها تا روز 8 پرورش و بعد از آن از مواد حاصل از فیلتر کردن سبوس برنج و سبوس گندم با قطر 50 میکرونی برای ادامه پرورش استفاده گردید. مخلوط عبور داده شده از فیلتر نهایی، به مدت چندین ساعت (10- 7 ساعت) به منظور ته نشین شدن ذرات غذایی در یخچال نگهداری شد. پس از مشاهده حالت ته نشینی ذرات، مایع رویی که حاوی آب و بخش های محلول (غیر قابل استفاده در تغذیه آرتمیا) بوده و همچنین چربیهای اضافی که می توانند در محیط ایجاد آلودگی کنند به آرامی دور ریخته شدند. با توجه به اینکه قسمت های محلول حاصل از این منابع غذایی در تغذیه آرتمیا کاربرد ندارند و حتی ممکن است باعث آلودگی محیط پرورشی نیز شوند، لذا تا حد امکان سعی شد بخش نهایی جمع آوری شده عاری از این مواد محلول باشد. لذا ذرات ته نشین شده به درون بشرهای 5 لیتری ریخته و آب به مقدار کافی به آن اضافه شد و به خوبی هوادهی شده و دوباره به مدت چند ساعت به منظور ته نشینی در یخچال قرار داده شد. بار دیگر مایع رویی که حالت تیره رنگ دارند به آرامی خارج شد ( این عمل در صورت نیاز چند بار تکرار شد تا مایع رویی کاملا شفاف شود).
3-3-2- مراحل تهیه غذا و نگهداری آن
با توجه به اینکه عمل غذادهی آرتمیا بر اساس وزن خشک غذا ها به ازای تعداد مشخصی آرتمیا انجام می گیرد، به منظور تسهیل تعیین میزان غذای روزانه آرتمیاها در تیمارهای مختلف این تحقیق، سوسپانسیون استخراج شده از سبوس گندم و سبوس برنج بطور جداگانه در داخل پتری دیش های شیشه ای ریخته و در داخل آنکوباتور 40 درجه سانتی گراد تا خشک شدن کامل آن، نگهداری شد. پس از این مراحل عصاره خشک شده حاصل از سبوس گندم و برنج درداخل ظروف در بسته در داخل یخچال نگهداری گردید. برای جلوگیری از فساد ناخواسته ترکیب غذایی بطور روزانه تهیه گردید.
3-4- تهیه آب شور
برای تهیه آب شور لازم جهت پرورش آرتمیا از آب اشباع دریاچه ارومیه (460- 400 گرم بر لیتر) و نمک دریا استفاده شد. بدین صورت که ابتدا آب دریا به منظور حذف زئوپلانکتون ها و هرگونه ذرات خارجی از فیلتر 100 میکرون عبور داده شده سپس با افزودن آب شیر به شوری مورد نظر (70 گرم بر لیتر) رسانده شد. و همچنین به علت اینکه میزان منیزیم موجود در آب دریا از حد معمول بیشتر بود از نمک دریا نیز آب شور تهیه شد و به میزان برابری از آب شور تهیه شده با نمک دریا و آب دریا برای پرورش آرتمیا استفاده گردید. برای تنظیم شوری از دستگاه شوری سنج مدل آتاگو ژاپن استفاده شد.
3-5- ضدعفونی کردن سیست ها قبل از تفریخ
ابتدا ppm200 از محلول هیپوکلرایت از طریق اضافه کردن ml20 محلول وایتکس ((Naocl در 10 لیتر آب تهیه گردید. سیست ها را با تراکم 50 گرم به ازای هر لیتر از این محلول به مدت 30 دقیقه غوطه ور کردیم. بعد از این مرحله سیست ها را زیر آب معمولی به خوبی شستشو

مطلب مرتبط :   ابن‌سینا، معلول، شر، ، قسم
دسته بندی : علمی