استفاده گردید.
نمونه کنترل منفی DNA ندارد و هم حجم DNA به نمونه کنترل منفی آب مقطر استریل اضافه شد. پس از انجام PCR کنترل منفی باید باندی نداشته باشد.
حجم نهایی مخلوط PCR برای هر نمونه 15 میکرولیتر است. سیکل مطلوب جهت انجام PCR ژن CagA در جدول زیر آمده است. الکتروفورز محصول تکثیر یافته PCR با استفاده از ژل آگارز انجام شد و پس از رنگ آمیزی مورد بررسی قرار گرفت.
جدول(3-3): برنامه PCRژن CagA.
Program Step Definition Temperature Time Cycle
Prog.1 1 Heat start 94 5MIN 1
Prog.2 1
2
3 Denaturation
Annealing
Extension 94
59
72 30S
30S
30S 30
30
30
Prog.3 1 Final
Extension 72 5MIN 1

3-7- روش¬های تهیه محلول¬ها ی آزمایش¬های مولکولی
3-7-1 -طرز تهیه بافر EDTA-Borate- Tris(TBE)
54 گرم پودر Tris-HCL
7/5 گرم اسید بوریک
EDTA 20 ml
1لیتر آب مقطر
PH:8

3-8-الکتروفورز ژل و Load کردن نمونه¬ها:
متداول¬ترین و ساده ترین روش بررسی محصولات PCR شامل الکتروفورز روی ژل استاندارد آگاروز1% است.

3-8-1-وسایل و مواد لازم:
– بافر الکتروفورز
– اتیدیوم بروماید
– ژل آگاروز
-لودینگ بافر
– مارکر مولکولی DNA با وزن 100 -1000
تانک الکتروفورز
– سمپلر و سر سمپلر
– دستگاه gel documentation

3-8-2 روش انجام الکتروفورز:
با استفاده از ترازوی دیجیتالی 2/0 گرم از پودر آگاروز را وزن کرده و در داخل ارلن به 20 سی سیTBE 1 X اضافه شد. سپس محلول، حرارت داده شد تا ذرات آگاروز کاملا حل شوند. پس از چند دقیقه که به دمای متعادل رسید داخل کست مخصوص ژل که حاوی شانه 15 خانه ای بود ریخته شد. پس از بستن کامل ژل در داخل کست، به آرامی شانه خارج شد. سپس کست داخل تانک الکتروفورز قرار داده شد. محتوای تانک از بافر x 1پر شد تا بافر تمام سطح ژل را بگیرد. سپس روی میز استریل یک قطعه پارافیلم استریل قرار داده و به تعداد نمونه¬ها ی PCR قطرات با حجم µl 3 از لودینگ بافر قرار داده شد.10 میکرولیتر از هر نمونه با 3 میکرولیتر لودینگ بافر مخلوط شد بدین ترتیب که با استفاده از سر سمپلرهای کریستالی استریل و مجزا برای هر نمونه، حجم 10 میکرولیتر از نمونه PCR برداشته شد. نوک سر سمپلر را در قطره لودینگ بافر فرو برده و نمونه PCR شده، چند بار با لودینگ بافر در داخل سر سمپلر مخلوط شد. سپس نمونه PCR شده و لودینگ بافر در چاهک¬های ژل الکتروفورز تزریق گردید. در چاهک اول نیز 6 میکرولیتر مارکر مولکولی 100-1000 قرار داده شد. در دو چاهک نیز از کنترل¬های مثبت و منفی استفاده شد. تانک الکتروفورز به دستگاه power supply متصل شد. قطب منفی دستگاه باید به سمت چاهک¬ها باشد زیرا DNA دارای بار منفی است و در ژل از قطب منفی به سمت قطب مثبت حرکت می¬کند دستگاه روی 70 ولت برای مدت 60 دقیقه تنظیم شد. پس از اتمام الکتروفورز ژل با احتیاط از تانک خارج شد و به مدت 10 دقیقه در محلول اتیدیوم بروماید قرار گرفت. سپس ژل را خارج کرده و به مدت 5 دقیقه در ظرف حاوی آب مقطر غوطه ور گردید تا اتیدیوم بروماید سطح ژل را کاملا شستشو دهد و سپس ژل در داخل دستگاه geldocumentation با نرم افزار Quantity-one-installer مورد بررسی قرار گرفت.

مطلب مرتبط :   ــــــ، پیاپی، ش2.، مشهد.، تهران:

3-9 روش تجزیه و تحلیل اطلاعات:
داده¬ها پس از ورود به نرم افزار آماری SPSS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. برای آنالیز فراوانی هر یک از ژن¬ها و ژنوتیپ¬ها از آزمون¬های فراوانی استفاده شد. برای تعیین ویژگی پرایمرها از نرم افزارهایی مانند اولیگوکالک، اولیگوآنالایزر و برای بررسی شباهت¬های سکانس ها از بلاست استفاده شد. برای تعیین ارتباط آماری بین ژنوتایپ و بیماری¬ها از آزمون کای دو استفاده شد.

فصل چهارم:

نتایج،بحث و پیشنهادات

4-1- نتایج مربوط به کشت هلیکوباکتر پیلوری
از120 بیمار مبتلا به بیماری¬های گاسترودئودنال مراجعه کننده به بخش آندوسکوپی بیمارستان امام رضا استان کرمانشاه دو نمونه بیوپسی بر اساس نمای بالینی معده از نواحی کورپوس و آنتروم توسط پزشک فوق تخصص بیماری¬های گوارشی گرفته شد. از این تعداد 59 نمونه مربوط به زنان و61 نمونه مربوط به مردان بود. و تعداد 52 (3/43% ) ایزوله هلیکوباکتر پیلوری جداسازی شد که 17 نمونه(16/14٪) مربوط به زنان و 35 نمونه (16/29 ٪) مربوط به مردان بود. سن بیماران مورد مطالعه بین 17-87 سال بود. در این بررسی میانگین سنی برای افراد با کشت مثبت 78/46 سال، در زنان 46/45٪ و در مردان 1/48٪ بود.

جدول (4-1): توزیع فراوانی مطلق ونسبی بیماران به تفکیک جنس و نتیجه کشت.
جمع کشت منفی کشت مثبت جنسیت
(1/49% ) 59 (35% ) 42 (1/14%) 17 زن
(8/50%) 61 (66/21%) 26 (1/29%) 35 مرد
(100%) 120 (6/56%) 68 (3/43%) 52 مجموع

4-2- فراوانی مطلق ونسبی هلیکوباکترپیلوری براساس نتایج کشت اوره-آز
از 120 نمونه بیوپسی گرفته شده از افراد مبتلا به بیماری¬های گوارشی، 65 (1/54%) نمونه در آزمون اوره¬آز سریع، مثبت و 55 (8/45%) مورد منفی شد. در کشت نمونه¬های بیوپسی52 (3/43%) نمونه مثبت و 68 (6/56%) نمونه منفی شد (جدول 4-2).

جدول 4-2 توزیع فراوانی مطلق ونسبی هلیکوباکتر پیلوری در افراد مبتلا به بیماری¬های گاسترودئودنال بر حسب تست اوره آز و کشت.

مجموع کشت منفی کشت مثبت کشت
اوره آز

(1/54%)65 (3/13%)16 (8/40%)49 اوره آزمثبت
(8/45%)55 (3/43%)52 (5/2%) 3 اوره آز منفی
(100%)120 (6/56%)68 (3/43%) 52 مجموع

از(1/54%)65 نمونه بیوپسی که با آزمون اوره¬آز مثبت شده بودند (6/44%) 29 بیمار زن و(3/55%) 36 بیمار مرد بودند. از(3/43%) 52 نمونه بیوپسی که توسط کشت مثبت شده بودند، (6/32%) 17 بیمار زن و(3/67%) 35 بیمار مرد بودند.
از 55 بیوپسی که در آزمون اوره¬آز منفی شدند، (5/45%)30 بیمار زن و(4/45%)25 بیمار مرد بودند. همچنین از(6/56%)68 نمونه بیوپسی منفی شده توسط کشت، (3/13%)16 بیمار زن و(3/43%)52 بیمار مرد بودند.

جدول 4-3 توزیع فراوانی مطلق ونسبی نتایج آزمون اوره¬آز سریع در بیماران مورد مطالعه بر اساس جنس.
مجموع منفی مثبت اوره آز
جنسیت
(1/49 %) 59 (5/54%)30 (6/44%) 29 زن
(8/50%)61 (4/45%)25 (3/55%) 36 مرد
(100%)120 (100%)55 (100%) 65 مجموع

جدول 4-4 –توزیع فراوانی مطلق و نسبی نتایج کشت در بیماران مورد مطالعه بر اساس جنس
مجموع منفی مثبت کشت
جنسیت
(1/49%)59 (7/61%)42 (6/32%)17 زن
(8/50%)61 (2/38%)26 (3/67%)35 مرد
(100%)120 (100%)68 (100%)52 مجموع

در این پژوهش برای ارزیابی گروه¬های سنی، بیماران به 4 گروه سنی از 15سال تا بالای 60 سال تقسیم¬بندی شدند. با توجه به جدول(4-5) گروه 45 تا 60 سال بیشترین تعداد بیماران مبتلا به گاستریت و گروه 15 تا 30 سال کمترین تعداد را به خود اختصاص داده است. از مجموع 50 (100%) نمونه بیوپسی که کشت آن¬ها مثبت شد،27 (54%) نفر مبتلا به گاستریت، 12(24%) نفر مبتلا به زخم معده و زخم اثنی عشر، 5 (10%) نفر مبتلا به سرطان معده و 6 (12%) نفر به NUD مبتلا بودند.

مطلب مرتبط :   زنان، درآمد، مردان، کودکان، پسران

جدول(4-5): توزیع فراوانی مطلق و نسبی گروه¬های سنی بیماران بر اساس وضعیت بالینی.

مجموع بالای 60 سال 45-60 30-45 15-30 سن
وضعیت بالینی
27(54%) 8(16%) 9(18%) 7(14 %) 3(6%) گاستریت
12(24%) 4 (8%) 2(4%) 2(4%) 4(8%) زخم
5(10%) 2(4%) 3(6%) 0 0 سرطان معده
6(12%) 0 1(2%) 2(4%) 3(6%) NUD
50(100%) 14(28%) 15(30%) 11(22%) 10(20%) مجموع

جدول 4-6- توزیع فراوانی مطلق و نسبی وضعیت بالینی بیماران با کشت مثبت، براساس جنس.
وضعیت بالینی
جنس گاستریت زخم سرطان NUD مجموع
زن 11(22%) 6 (12%) 0 1(2%) 18(36%)
مرد 16(32%) 6(12%) 5 (10%) 5(10%) 32(64%)
مجموع 27(54%) 12(24%) 5(10%) 6 (12%) 50(100%)

4-3- نتایج PCR انجام شده
بر روی 50 نمونه DNA استخراج شده، از کشت بیوپسی¬های بیماران گوارشی، PCR برای شناسایی ژن CagA صورت گرفت. ژن CagA در40 (80%) مورد از نمونه¬ها مثبت و در 10 (20%) نمونه منفی شد که از این تعداد (5/32%) 13 مورد زن (5/67%) 27 مورد مرد بودند.

مجموع منفی مثبت PCR

جنسیت
(36%)18 (10%)5 (5/32%) 13 زن
(64%)32 (10%)5 (5/67%) 27 مرد
(100%)50 (20%)10 (80%) 40 مجموع
جدول4-7 توزیع فراوانی مطلق ونسبی نتایج PCR بر اساس جنسیت.

شکل (4-1): چاهک شماره 1 از سمت چپ نمونه کنترل مثبت ژن cagA، چاهک شماره 2 از سمت چپ نمونه کنترل منفی ژن cagA، چاهک شماره 3 از سمت چپ نمونه مثبت PCR (bp 770(، چاهک 4 مربوط به سویه فاقد ژن cagA، چاهک های 5 و6 و7 نمونه های مثبت دارای ژن cagA.

جدول 4-7 توزیع فراوانی مطلق و نسبی حضور ژن cagA براساس وضعیت بالینی بیماران در این بررسی.
کل NUD سرطان زخم گاستریت
وضعیت بالینی ژن cagA
40 (80%) 5 (3/83%) 4 (80%) 11 (6/91%) 20 (74 %) موارد مثبت
10 (20%) 1 (6/16%) 1(20%) 1 (3/8%) 7 (9/25%) موارد منفی
50(100%) 6(12%) 5(10%) 12(24%) 27(54%) مجموع

(درجه معناداری)P: .252
آنالیز آماری نشان داد که بین وضعیت بالینی بیماران و ژن CagA ارتباط معنا داری وجود ندارد.
از مجموع 40 سویه هلیکوباکتر پیلوری CagAمثبت جدا شده، از بیماران مبتلا به بیماری¬های گاسترودئودنال، 20 نفر مبتلا به گاستریت،11 بیمار مبتلا به زخم¬های معده و اثنی¬عشر، 4 نفر مبتلا به سرطان معده و6 نفر دیس¬پپسی داشتند. بعد از انجام فرایند PCR، محصولات PCR تعیین توالی شدند. نتایج حاصل از تعیین توالی با استفاده از نرم افزار clustal W2 با هم مقایسه شدند و توالی¬های DNA به آمینو اسید تبدیل شده، آمینواسید ها با clustal W2 هم مقایسه شدند و در نهایت توسط NCBI بلاست با سایر توالی¬های موجود مقایسه شدند.
از بین 40 مورد هلیکوباکتر پیلوری CagA مثبت ایزوله از بیماران مبتلا به ناراحتی¬های گوارشی، همه¬ی ژن¬های CagA از نوع غربی بودند. و موتیف¬های EPIYA، از نوع EPIYA-C 35 مورد(5/87%) بودند. 2(5%)مورد از نوع موتیف EPIYA-AB و3 (5/7%) مورد از نوع موتیف¬هایEPIYA-CC بود.
فراوانی موتیف EPIYA-C در بین بیماران مبتلا به و زخم معده و گاستریت بیشتر بود. وهیچ¬گونه موتیف نوع EPIYA-D آسیای شرقی در ایزوله¬ها مشاهده نشد. فراوانی موتیف EPIYA-CC در دو مورد از بیماران مبتلا به سرطان یافت شد.

دسته بندی : علمی